程水連 何建國 黃 靜 盧桂英

(國家黑茶產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖南 益陽 413000)

為了防治茶樹的各種病蟲害，長期以來化學(xué)農(nóng)藥在茶園中被廣泛使用，農(nóng)藥的使用一方面提高了茶葉的產(chǎn)量，另一方面農(nóng)藥殘留對人體將造成極其大的傷害，能導(dǎo)致身體免疫力下降、加重肝臟負擔(dān)、導(dǎo)致胃腸道疾病、還存在致癌的風(fēng)險,并且污染環(huán)境，破壞生態(tài)。為此，中國農(nóng)業(yè)部先后發(fā)布了[2002]194號、[2002]199號、[2003]274號公告文件，列出了禁用農(nóng)藥和限用農(nóng)藥清單[1-3]。在GB 2763—2014《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了茶葉中農(nóng)殘限量指標。因此農(nóng)藥殘留問題一直是茶葉檢測的重中之重，有必要建立一種準確、快速、可靠的農(nóng)藥多殘留檢測方法對黑茶中的農(nóng)藥殘留進行測定。

目前，茶葉中農(nóng)藥殘留涉及GB/T 23204—2008中氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測的有14種，而且鑒于中國還未建立氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)的相關(guān)方法，基于GB/T 23204—2008中的單四級桿氣質(zhì)法，本試驗擬采用靈敏度更高的氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)來建立黑茶中苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈9種農(nóng)藥殘留檢測的方法。吳易峰[4]采用氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)法測定茶葉中20種農(nóng)藥殘留，但與本研究的農(nóng)藥品名不同。茶葉中這9種農(nóng)藥殘留的檢測在GB/T 23204—2008中只明確規(guī)定了8種，未包含啶蟲脒，且該標準所涉及的只有綠茶、紅茶、普洱茶和烏龍茶四類，未包含黑茶，且GB/T 23204—2008的前處理用到的甲苯毒害大。本試驗擬用正己烷—丙酮預(yù)洗固相凈化柱和只采用乙腈為洗脫液、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的MRM采集方式進行測定。以期為黑茶產(chǎn)品中建立高效的多種農(nóng)殘檢測技術(shù)提供參考，同時為日常食品安全監(jiān)管工作提供強有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器

三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-TQ8040型，具有EI源，日本島津公司；

電子分析天平：AEY-210型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

電子天平：AUW120D型，日本島津公司；

均質(zhì)器：AVS-100型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV321型，萊伯泰科儀器股份公司；

八通道濃縮儀：Multivap-8型，萊伯泰科儀器股份公司；

離心機：TD5型，長沙英泰儀器有限公司；

一次性Cleanert TPT固相萃取柱：2 g/10 mL，浙江月旭科技有限公司；

有機相微孔濾膜：0.22 μm，浙江月旭科技有限公司。

1.2 試劑

苯醚甲環(huán)唑-1和-2、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈標準溶液(甲醇溶液)：均為1 000 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；

甲苯：分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；

丙酮：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、正己烷、甲醇：色譜純，德國Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Rxi-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：290 ℃；柱溫：程序升溫，80 ℃(保持0 min)，以15 ℃/min升至300 ℃，保持14 min；載氣控制方式：恒線速度；壓力：115.2 kPa；進樣方式：不分流進樣；總流量：50.0 mL/min；柱流量：1.69 mL/min；載氣線速度：47.9 cm/s；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃；檢測器電壓：調(diào)諧電壓+0.6 kV；溶劑延遲時間：2.50 min；采集模式：MRM，離子信息見表1。

1.3.2 標準曲線制備

(1) 9種農(nóng)殘混合標準儲備液配制：分別移取上述9種農(nóng)殘標準溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到50 mg/L混合標準儲備液。

(2) 9種農(nóng)殘混合標準使用液配制：分別移取上述儲備液0.20，0.40，0.80，1.20，1.60 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別得到約0.4，0.8，1.6，2.4，3.2 mg/L 混合標準使用液。

1.3.3 樣品處理

(1) 提?。簻蚀_稱取粉碎過20 目篩的2 g黑茶試樣(精確至0.000 1 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，15 000 r/min均質(zhì)提取1 min，4 200 r/min離心5 min后取上清液，殘渣再用10 mL乙腈均質(zhì)提取1次，合并提取液于100 mL圓底燒瓶中，于40 ℃水浴中減壓濃縮至凈干，待凈化。

(2) 凈化、定容：用10mL正己烷—丙酮(體積比1∶1)溶液預(yù)洗一次性Cleanert TPT固相萃取柱，保持TPT柱濕潤，棄去流出液。下接與八通道濃縮儀配套的80 mL瓶，放入固定架上。將上述提取樣品用2 mL乙腈清洗瓶壁并將此溶液小心全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)清洗TPT柱中，用2 mL乙腈洗滌樣液瓶，重復(fù)3次，并將洗滌液移入TPT柱中，再用30 mL乙腈洗滌TPT柱，收集上述所有流出液于與八通道濃縮儀配套的80 mL瓶中，于40 ℃水浴中氮吹濃縮至1.0 mL，加入5 mL甲醇進行溶劑交換，重復(fù)3次。定容至1.0 mL，經(jīng)0.45 μm 有機系濾膜過濾至進樣瓶中，供GC-MS/MS檢測，以色譜峰面積外標法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

黑茶中這9種農(nóng)殘含量測定的數(shù)據(jù)處理采用外標法，以色譜峰峰面積歸一化來定量計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

由于黑茶中不含油脂，故在凈化的過程中不必考慮去除油脂的問題，所以在提取過程中只要選擇一種合適的有機溶劑能起到有效提取混合農(nóng)藥即可[5-7]。由于本試驗中這9種農(nóng)藥均為弱極性有機化合物，而且GB/T 23204—2008中所用到的提取溶劑為乙腈+甲苯(體積比3∶1)，由于甲苯具有相對大的毒性，且黑茶中含有大量的色素，前處理要求較高[8-10]。所以擬研究乙腈、乙酸乙酯、正己烷和丙酮為提取溶劑的提取效果。結(jié)果見表2。

表1 9種農(nóng)藥組分保留時間及MRM參數(shù)Table 1 Retention time and MRM parameter of nine kinds of pesticide components

從表2可看出，乙腈對這9種農(nóng)藥的回收率比乙酸乙酯+ 正己烷(體積比1∶1)和正己烷+丙酮(體積比1∶1)的回收率高，而且用乙酸乙酯+正己烷(體積比1∶1)和正己烷+丙酮(體積比1∶1)作提取劑時提取的色素等雜質(zhì)較多，對儀器的干擾較大；用乙腈作提取劑時提取的干擾較小，而且回收率也能達到要求，故本研究采取乙腈作為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對分析物的回收率Table 2 Recovery of analyte with different extraction solvents %

2.2 儀器條件的優(yōu)化

根據(jù)GC-MS/MS母離子和子離子所對應(yīng)的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，通過設(shè)定多個時間段和掃描離子通道同時分析這9種農(nóng)藥成分，先通過GC-MS對其分離和全掃描(SCAN)(圖1)，確定農(nóng)藥的出峰時間(表1)和一級碎片離子，選擇離子強度高的一級碎片離子作為母離子(表1)。子離子掃描時，利用EI源對離子轟擊掃描模式對母離子在不同碰撞能量下進行二次電離，選擇2個信號較強的二級碎片離子作為子離子，選擇豐度高且穩(wěn)定的離子做定量離子(表1)，以產(chǎn)生信號強度最強的碰撞能量作為最終優(yōu)化碰撞能量，這9種待測農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)見圖2。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

使用9種農(nóng)殘標準品的濃度0.4，0.8，1.6，2.4，3.2 mg/L混合標準使用液，以濃度作橫坐標x，峰面積作縱坐標y，對測定結(jié)果進行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限見表3。

2.4 回收率和精密度

取同一批次的黑茶樣品，粉粹，過篩，準確稱取10 g(精確至0.01 g)，分別加入2種標樣添加水平(400，800 ng)，按上述試驗條件進行加標回收試驗，每個水平進行5次平行測定，各濃度農(nóng)藥的加標回收率(5次平行樣回收率及RSDs)結(jié)果見表4。

圖1 9種待測農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(TIC)

Figure 1 Multi reaction monitoring chromatograms of nine kinds of detected pesticides(TIC)

圖2 9種農(nóng)殘標準物質(zhì)的MRM圖Figure 2 MRMFigure of standard materials for nine kinds of pesticide residues表3 各農(nóng)藥組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficient, LODs and LOQs of pesticides

組分線性方程R2檢出限/(μg·kg-1) 定量限/(μg·kg-1)異稻瘟凈y=3 017 003.5x-568 732.70.998 70.351.07三唑酮y=2 164 137.3x-492 542.20.998 20.170.59噻螨酮y=573 217.9x-102 201.80.999 40.260.86噻嗪酮y=1 404 423.0x-147 278.80.999 10.080.20啶蟲脒y=182 771.4x-47 445.40.998 20.210.76溴螨酯y=1 598 839.5x-278 166.00.998 60.300.95三氯殺螨砜y=783 876.5x-53 028.0 0.998 70.190.63噠螨靈y=5 173 132.0x-265 724.50.998 00.050.17苯醚甲環(huán)唑-1y=1 146 224.8x-98 898.70.998 80.110.47苯醚甲環(huán)唑-2y=4 480 249.1x-742 795.10.993 50.140.51

表4 農(nóng)藥組分的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of pesticide

從表4可以看出，這9種農(nóng)藥的平均加標回收率為81.6%～98.6%；5次平行樣的相對標準偏差為1.5%～5.6%，滿足試驗要求。

2.5 實際黑茶樣品分析

利用所建立的分析方法對益陽安化黑茶共6類樣品進行了這9種農(nóng)殘檢測。在不同種類的黑茶樣品中均檢測到不同濃度的農(nóng)殘，其中以異稻瘟凈、噻螨酮、啶蟲脒、溴螨酯、苯醚甲環(huán)唑居多，濃度范圍為0.02～0.18 mg/kg，均符合茶葉產(chǎn)品農(nóng)殘限量的要求，詳見表5。

表5 實際黑茶樣品的測定結(jié)果Table 5 Determination result of the actual tea samples

3 結(jié)論

本試驗建立了以乙腈為提取溶劑，用正己烷—丙酮預(yù)洗固相凈化柱，采用乙腈為洗脫液、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的MRM采集方式測定，對黑茶中9種農(nóng)藥殘留進行了定性和定量分析。試驗結(jié)果表明：該方法前處理操作簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，在分別加入2種標樣添加水平(400，800 ng)下，這9種農(nóng)藥的回收率均為81.6%～98.6%，滿足日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作的需要；且對GB/T 23204—2008中的農(nóng)藥殘留檢測加以補充；同時結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)中的MRM采集方式，不僅避免了雜質(zhì)干擾，而且有效地消除了基質(zhì)對這9種農(nóng)藥殘留含量測定的干擾，降低了檢出限，減少了假陽性的檢出率，能夠提高分析的選擇性和檢測靈敏度，適用于黑茶中苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈9種農(nóng)藥殘留的檢測。