程水連 何建國 黃 靜 盧桂英

(國家黑茶產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖南 益陽 413000)

為了防治茶樹的各種病蟲害，長期以來化學(xué)農(nóng)藥在茶園中被廣泛使用，農(nóng)藥的使用一方面提高了茶葉的產(chǎn)量，另一方面農(nóng)藥殘留對人體將造成極其大的傷害，能導(dǎo)致身體免疫力下降、加重肝臟負(fù)擔(dān)、導(dǎo)致胃腸道疾病、還存在致癌的風(fēng)險,并且污染環(huán)境，破壞生態(tài)。為此，中國農(nóng)業(yè)部先后發(fā)布了[2002]194號、[2002]199號、[2003]274號公告文件，列出了禁用農(nóng)藥和限用農(nóng)藥清單[1-3]。在GB 2763—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了茶葉中農(nóng)殘限量指標(biāo)。因此農(nóng)藥殘留問題一直是茶葉檢測的重中之重，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、可靠的農(nóng)藥多殘留檢測方法對黑茶中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定。

目前，茶葉中農(nóng)藥殘留涉及GB/T 23204—2008中氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測的有14種，而且鑒于中國還未建立氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)的相關(guān)方法，基于GB/T 23204—2008中的單四級桿氣質(zhì)法，本試驗擬采用靈敏度更高的氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)來建立黑茶中苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈9種農(nóng)藥殘留檢測的方法。吳易峰[4]采用氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)法測定茶葉中20種農(nóng)藥殘留，但與本研究的農(nóng)藥品名不同。茶葉中這9種農(nóng)藥殘留的檢測在GB/T 23204—2008中只明確規(guī)定了8種，未包含啶蟲脒，且該標(biāo)準(zhǔn)所涉及的只有綠茶、紅茶、普洱茶和烏龍茶四類，未包含黑茶，且GB/T 23204—2008的前處理用到的甲苯毒害大。本試驗擬用正己烷—丙酮預(yù)洗固相凈化柱和只采用乙腈為洗脫液、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的MRM采集方式進(jìn)行測定。以期為黑茶產(chǎn)品中建立高效的多種農(nóng)殘檢測技術(shù)提供參考，同時為日常食品安全監(jiān)管工作提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器

三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-TQ8040型，具有EI源，日本島津公司；

電子分析天平：AEY-210型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

電子天平：AUW120D型，日本島津公司；

均質(zhì)器：AVS-100型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV321型，萊伯泰科儀器股份公司；

八通道濃縮儀：Multivap-8型，萊伯泰科儀器股份公司；

離心機(jī)：TD5型，長沙英泰儀器有限公司；

一次性Cleanert TPT固相萃取柱：2 g/10 mL，浙江月旭科技有限公司；

有機(jī)相微孔濾膜：0.22 μm，浙江月旭科技有限公司。

1.2 試劑

苯醚甲環(huán)唑-1和-2、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲醇溶液)：均為1 000 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；

甲苯：分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；

丙酮：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、正己烷、甲醇：色譜純，德國Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Rxi-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：290 ℃；柱溫：程序升溫，80 ℃(保持0 min)，以15 ℃/min升至300 ℃，保持14 min；載氣控制方式：恒線速度；壓力：115.2 kPa；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；總流量：50.0 mL/min；柱流量：1.69 mL/min；載氣線速度：47.9 cm/s；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃；檢測器電壓：調(diào)諧電壓+0.6 kV；溶劑延遲時間：2.50 min；采集模式：MRM，離子信息見表1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

(1) 9種農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別移取上述9種農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

(2) 9種農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：分別移取上述儲備液0.20，0.40，0.80，1.20，1.60 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別得到約0.4，0.8，1.6，2.4，3.2 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.3 樣品處理

(1) 提?。簻?zhǔn)確稱取粉碎過20 目篩的2 g黑茶試樣(精確至0.000 1 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，15 000 r/min均質(zhì)提取1 min，4 200 r/min離心5 min后取上清液，殘渣再用10 mL乙腈均質(zhì)提取1次，合并提取液于100 mL圓底燒瓶中，于40 ℃水浴中減壓濃縮至凈干，待凈化。

(2) 凈化、定容：用10mL正己烷—丙酮(體積比1∶1)溶液預(yù)洗一次性Cleanert TPT固相萃取柱，保持TPT柱濕潤，棄去流出液。下接與八通道濃縮儀配套的80 mL瓶，放入固定架上。將上述提取樣品用2 mL乙腈清洗瓶壁并將此溶液小心全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)清洗TPT柱中，用2 mL乙腈洗滌樣液瓶，重復(fù)3次，并將洗滌液移入TPT柱中，再用30 mL乙腈洗滌TPT柱，收集上述所有流出液于與八通道濃縮儀配套的80 mL瓶中，于40 ℃水浴中氮吹濃縮至1.0 mL，加入5 mL甲醇進(jìn)行溶劑交換，重復(fù)3次。定容至1.0 mL，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，供GC-MS/MS檢測，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

黑茶中這9種農(nóng)殘含量測定的數(shù)據(jù)處理采用外標(biāo)法，以色譜峰峰面積歸一化來定量計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

由于黑茶中不含油脂，故在凈化的過程中不必考慮去除油脂的問題，所以在提取過程中只要選擇一種合適的有機(jī)溶劑能起到有效提取混合農(nóng)藥即可[5-7]。由于本試驗中這9種農(nóng)藥均為弱極性有機(jī)化合物，而且GB/T 23204—2008中所用到的提取溶劑為乙腈+甲苯(體積比3∶1)，由于甲苯具有相對大的毒性，且黑茶中含有大量的色素，前處理要求較高[8-10]。所以擬研究乙腈、乙酸乙酯、正己烷和丙酮為提取溶劑的提取效果。結(jié)果見表2。

表1 9種農(nóng)藥組分保留時間及MRM參數(shù)Table 1 Retention time and MRM parameter of nine kinds of pesticide components

從表2可看出，乙腈對這9種農(nóng)藥的回收率比乙酸乙酯+ 正己烷(體積比1∶1)和正己烷+丙酮(體積比1∶1)的回收率高，而且用乙酸乙酯+正己烷(體積比1∶1)和正己烷+丙酮(體積比1∶1)作提取劑時提取的色素等雜質(zhì)較多，對儀器的干擾較大；用乙腈作提取劑時提取的干擾較小，而且回收率也能達(dá)到要求，故本研究采取乙腈作為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對分析物的回收率Table 2 Recovery of analyte with different extraction solvents %

2.2 儀器條件的優(yōu)化

根據(jù)GC-MS/MS母離子和子離子所對應(yīng)的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，通過設(shè)定多個時間段和掃描離子通道同時分析這9種農(nóng)藥成分，先通過GC-MS對其分離和全掃描(SCAN)(圖1)，確定農(nóng)藥的出峰時間(表1)和一級碎片離子，選擇離子強(qiáng)度高的一級碎片離子作為母離子(表1)。子離子掃描時，利用EI源對離子轟擊掃描模式對母離子在不同碰撞能量下進(jìn)行二次電離，選擇2個信號較強(qiáng)的二級碎片離子作為子離子，選擇豐度高且穩(wěn)定的離子做定量離子(表1)，以產(chǎn)生信號強(qiáng)度最強(qiáng)的碰撞能量作為最終優(yōu)化碰撞能量，這9種待測農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)見圖2。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

使用9種農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)品的濃度0.4，0.8，1.6，2.4，3.2 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，以濃度作橫坐標(biāo)x，峰面積作縱坐標(biāo)y，對測定結(jié)果進(jìn)行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限見表3。

2.4 回收率和精密度

取同一批次的黑茶樣品，粉粹，過篩，準(zhǔn)確稱取10 g(精確至0.01 g)，分別加入2種標(biāo)樣添加水平(400，800 ng)，按上述試驗條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個水平進(jìn)行5次平行測定，各濃度農(nóng)藥的加標(biāo)回收率(5次平行樣回收率及RSDs)結(jié)果見表4。

圖1 9種待測農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(TIC)

Figure 1 Multi reaction monitoring chromatograms of nine kinds of detected pesticides(TIC)

圖2 9種農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的MRM圖Figure 2 MRMFigure of standard materials for nine kinds of pesticide residues表3 各農(nóng)藥組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficient, LODs and LOQs of pesticides

組分線性方程R2檢出限/(μg·kg-1) 定量限/(μg·kg-1)異稻瘟凈y=3 017 003.5x-568 732.70.998 70.351.07三唑酮y=2 164 137.3x-492 542.20.998 20.170.59噻螨酮y=573 217.9x-102 201.80.999 40.260.86噻嗪酮y=1 404 423.0x-147 278.80.999 10.080.20啶蟲脒y=182 771.4x-47 445.40.998 20.210.76溴螨酯y=1 598 839.5x-278 166.00.998 60.300.95三氯殺螨砜y=783 876.5x-53 028.0 0.998 70.190.63噠螨靈y=5 173 132.0x-265 724.50.998 00.050.17苯醚甲環(huán)唑-1y=1 146 224.8x-98 898.70.998 80.110.47苯醚甲環(huán)唑-2y=4 480 249.1x-742 795.10.993 50.140.51

表4 農(nóng)藥組分的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of pesticide

從表4可以看出，這9種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為81.6%～98.6%；5次平行樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～5.6%，滿足試驗要求。

2.5 實際黑茶樣品分析

利用所建立的分析方法對益陽安化黑茶共6類樣品進(jìn)行了這9種農(nóng)殘檢測。在不同種類的黑茶樣品中均檢測到不同濃度的農(nóng)殘，其中以異稻瘟凈、噻螨酮、啶蟲脒、溴螨酯、苯醚甲環(huán)唑居多，濃度范圍為0.02～0.18 mg/kg，均符合茶葉產(chǎn)品農(nóng)殘限量的要求，詳見表5。

表5 實際黑茶樣品的測定結(jié)果Table 5 Determination result of the actual tea samples

3 結(jié)論

本試驗建立了以乙腈為提取溶劑，用正己烷—丙酮預(yù)洗固相凈化柱，采用乙腈為洗脫液、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的MRM采集方式測定，對黑茶中9種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了定性和定量分析。試驗結(jié)果表明：該方法前處理操作簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，在分別加入2種標(biāo)樣添加水平(400，800 ng)下，這9種農(nóng)藥的回收率均為81.6%～98.6%，滿足日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作的需要；且對GB/T 23204—2008中的農(nóng)藥殘留檢測加以補(bǔ)充；同時結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)中的MRM采集方式，不僅避免了雜質(zhì)干擾，而且有效地消除了基質(zhì)對這9種農(nóng)藥殘留含量測定的干擾，降低了檢出限，減少了假陽性的檢出率，能夠提高分析的選擇性和檢測靈敏度，適用于黑茶中苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、啶蟲脒、噻螨酮、噻嗪酮、三氯殺螨砜、三唑酮、溴螨酯、異稻瘟凈9種農(nóng)藥殘留的檢測。