俞 晨，白小翠，黨二樂，王 剛

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院(西安 710032)

主題詞 銀屑病/中醫(yī)藥療法 芍藥苷/治療應(yīng)用 動物實驗 小鼠

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，臨床以鱗屑性紅斑或斑塊為主要表現(xiàn)，我國是銀屑病“大國”，人群患病率約為0.5%，患者總數(shù)超過600 萬[1]。該病確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為異常活化的角質(zhì)形成細(xì)胞與T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞在皮膚局部相互作用是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖既是疾病主要的病理改變，又是疾病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素[2-3]。銀屑病固有的長久病程和易于反復(fù)，使其成為臨床難治的疾病之一，目前的治療方法在療效和安全性方面雖有優(yōu)勢，但也都還存在療效難以維持、不良反應(yīng)較多的問題，令人不盡滿意[4-7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為銀屑病屬于“白疕”范疇，經(jīng)過后世醫(yī)家的傳承及發(fā)揮，形成從血論治、從臟腑論治、從邪論治等多種辨證施治的方法[8]，臨床實踐中體現(xiàn)了療法多樣、方藥豐富、劑型多種、副作用少等優(yōu)勢，在口服及外用中藥制劑的臨床療效觀察及實驗研究等方面均取得了一定成績，尤其在提高療效、減少復(fù)發(fā)、降低副反應(yīng)及經(jīng)濟(jì)實用等方面優(yōu)勢明顯。在各類型中藥復(fù)方中，白芍等清熱涼血類藥物最為常用，我們的前期臨床研究也證實，以芍藥苷(Paeoniflorin, PF)為主要成分的白芍總苷(Total glucosides of paeonia，TGP)可有效改善中重度銀屑病癥狀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實這類藥物有效活性成分具有顯著且可靠的抗炎和抗增殖作用，并從參與銀屑病發(fā)病的免疫細(xì)胞紊亂角度解釋了TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理，但對影響銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的作用仍不明確，限制了對單味中藥劑型及用法更有效地開發(fā)和應(yīng)用。本研究擬通動物模型觀察外用芍藥苷對銀屑病表型的緩解及治療作用，以此初步探討芍藥苷對銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的影響，以期為進(jìn)一步開發(fā)芍藥苷在皮膚科的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 動物模型制備及給藥 于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心購買12只體重30 g左右雌性近交系BALB/c小鼠，培養(yǎng)于本校動物實驗中心飼養(yǎng)在恒溫恒濕的SPF級屏障環(huán)境內(nèi)。隨機(jī)分為空白、IMQ造模、治療低劑量及高劑量四組。BALB/c小鼠耳部剃毛后，后三組小鼠連續(xù)7 d每天上午耳部涂抹250 mg∶12.5 mg咪喹莫特乳膏一次，制備咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型。治療組在建模過程中同時給小鼠耳部皮膚連續(xù)外用涂抹不同濃度的PF，低劑量組給予PF 10 μg/(次·鼠)，高劑量組給予PF1mg/(次·鼠)，觀察各組小鼠模型局部出現(xiàn)紅斑鱗屑后，進(jìn)行取材

2 實驗藥品 芍藥苷原料由寧波朗生醫(yī)藥有限公司提供；咪喹莫特乳膏有英國3M Health Care Limited生產(chǎn)，注冊證號H2016007。

3 觀察方法 銀屑病樣小鼠模型外用芍藥苷治療對比分析：觀察小鼠大體變化，對比紅斑、鱗屑程度。將收集的小鼠皮損梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行HE染色，NDP.view軟件測量鼠耳表皮厚度，對比炎癥細(xì)胞浸潤程度。

結(jié) 果

1 四組小鼠表型比較 給予BALB/c小鼠連續(xù)外用咪喹莫特乳膏7 d進(jìn)行銀屑病建模，大體觀察耳部皮膚發(fā)現(xiàn)小鼠耳部變紅，增大，表面附有鱗屑，血管擴(kuò)張明顯。在建模過程中，同時給小鼠皮膚連續(xù)外用涂抹不同濃度的PF，低劑量組10μg/(次·鼠)及高劑量組1 mg/(次·鼠)，7 d后觀察小鼠表型，與IMQ組相比較，外用涂抹PF后小鼠紅斑鱗屑明顯減輕，表皮厚度明顯減輕(圖1)。

2 四組小鼠耳緣表皮厚度比較 通過測量耳緣厚度發(fā)現(xiàn)，空白組、咪喹莫特組、PF低劑量組及PF高劑量組的表皮厚度分別為0.27 mm、0.58 mm、0.52 mm、0.41 mm，治療組與咪喹莫特組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

3 四組小鼠皮膚組織病理檢查比較 將耳朵進(jìn)行皮膚組織病理檢查，HE染色顯示：與空白組相比，咪喹莫特組小鼠耳部出現(xiàn)角化不全、角化過度，表皮棘層增厚明顯，真皮淺層血管擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤，而兩組PF治療組均顯著的緩解了以上銀屑病的表型，真皮浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖1 小鼠模型銀屑病表型(紅斑、鱗屑)變化

圖2 大體組織耳緣厚度變化

圖3 皮膚組織病理學(xué)改變( HE染色 ×10 )

4 四組小鼠組織病理表皮厚度比較 將病理切片中表皮厚度進(jìn)行量化發(fā)現(xiàn)空白組組、米喹莫特組、PF低劑量組及PF高劑量組的表皮厚度分別為15.54 μm、77.92 μm、40.86 μm、32.3 μm，芍藥苷治療組與米喹莫特組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4)。

以上結(jié)果均提示外用PF能夠直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞緩解銀屑病表型，并且PF的治療作用隨劑量的增加而增強(qiáng)，從而達(dá)到治療銀屑病的作用。

圖4 組織病理表皮厚度

討 論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全闡明，目前比較公認(rèn)的銀屑病的發(fā)病機(jī)制為，在皮膚應(yīng)激、損傷等誘因的作用下，遺傳易感性個體的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞被激活，激活的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)、產(chǎn)生多種免疫活性物質(zhì)[2]，這些免疫活性物質(zhì)通過介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)一步活化，或趨化、活化中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等固有免疫成分[3]，啟動異常的免疫應(yīng)答并進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生異常的分化、活化。被活化的T細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過分泌大量細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-23和IL-17A等作用于表皮，進(jìn)一步激活角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)其增殖發(fā)生銀屑病的病理改變。

白芍總苷(Total glucosides of paeonia，TGP)是從中藥白芍中提取的有效成分，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷以及苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷(Paeoniflorin, PF)占90%，是其主要有效成分。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對TGP/PF的藥理作用展開了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、止痛、保肝、調(diào)節(jié)免疫以及影響細(xì)胞增殖等多種藥理作用，被認(rèn)為是一種高效的抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，在多個環(huán)節(jié)影響自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)的免疫細(xì)胞功能、抗原提呈過程和炎癥因子表達(dá)[9-10]。因此，TGP/PF被皮膚科醫(yī)生所認(rèn)可，并嘗試用于治療銀屑病、特應(yīng)性皮炎等免疫相關(guān)性慢性皮膚病的治療，臨床報道療效確切[11-12]。我們牽頭開展的多中心、隨機(jī)、雙盲、平行對照臨床研究(ClinialTrials.gov 注冊登記號: NCT02191020)發(fā)現(xiàn)，TGP聯(lián)合阿維A治療中重度斑塊狀銀屑病，在有效性和安全性方面均優(yōu)于單用阿維A治療，在明顯提高療效的同時還顯著降低了肝功能損害等不良反應(yīng)的發(fā)生[13]。

對于TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理研究，目前多圍繞其免疫調(diào)節(jié)作用展開。已有研究發(fā)現(xiàn)，①TGP/PF可明顯降低Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平[14-15]，抑制銀屑病動物模型炎細(xì)胞浸潤[16];②TGP/PF通過NF-κB和ERK通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生和白細(xì)胞遷移從而發(fā)揮抗炎作用[17];③TGP/PF可在體內(nèi)體外抑制血管新生[18]，從參與銀屑病發(fā)病的免疫細(xì)胞紊亂角度解釋了TGP/PF治療銀屑病的作用機(jī)理。目前針對TGP/PF作用于角質(zhì)形成細(xì)胞的研究較少。有學(xué)者報道[19-20]，TGP能明顯抑制INF-γ誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活力，同時明顯降低IL-23、VEGF等銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子的水平，提示TGP/PF可直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)揮其抗炎功能，但是其具體作用靶點及調(diào)控機(jī)制尚不明確。

我們的研究從動物實驗入手，嘗試使用芍藥苷外用涂抹于銀屑病模型小鼠，觀察其對銀屑病表型的緩解及治療作用，結(jié)果顯示外用PF能夠以劑量依賴性的方式有效緩解銀屑病樣表型，真皮浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量也受到明顯的抑制，提示芍藥苷可作用于銀屑病表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，抑制其異常增殖，從而達(dá)到治療銀屑病的作用。為進(jìn)一步開發(fā)芍藥苷在皮膚科的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。其具體的作用靶點及調(diào)控信號通路機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。