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(1.鄭州中道生物技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450000； 2.河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450000)

0 引言

真菌毒素是真菌在生產(chǎn)繁殖過程中產(chǎn)生的次生有毒代謝產(chǎn)物，人或牲畜使用了被產(chǎn)毒真菌及其毒素污染的食品或飼料可引起中毒及某些慢性疾病，具有強(qiáng)烈的致畸性、致癌性、致突變性[1]。在GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，黃曲霉毒素B1(AFB1)在玉米糝中限量值為20 μg/kg、大米中限量值為10 μg/kg，飼料原料中的最低限量值為10～50 μg/kg，飼料制品的最低限量值為10～30 μg/kg[2-3]。免疫膠體金法較實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜法(HPLC)，具有操作簡單，快速，費(fèi)用低廉的特點(diǎn)，且作為真菌毒素現(xiàn)場快速檢測得到了國家食品藥品監(jiān)督管理局(現(xiàn)國家市場監(jiān)督管理總局)的認(rèn)可[4]。而對其性能指標(biāo)的驗(yàn)證對該試劑條的臨床實(shí)踐的應(yīng)用至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃曲霉素B1(AFB1)單克隆抗體、AFB1-牛血清白蛋白(BSA)、山羊抗小鼠IgG購自洛陽佰奧通生物技術(shù)有限公司，AFB1[GBW(E)100302]標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，陰性盲樣:實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜法(HPLC)確定的不含AFB1的玉米糝空白樣本50份，及0.5倍檢出水平的陰性樣本50份；陽性盲樣：實(shí)驗(yàn)室HPLC法確證玉米糝加標(biāo)至1倍檢出水平和2倍檢出水平的陽性樣本各50份。

1.2 方法

1.2.1 真菌毒素免疫膠體金層析法試劑條的制備

通過將膠體金標(biāo)記的單克隆抗體(以下簡稱金標(biāo)抗體)噴在玻璃纖維上制成結(jié)合墊，將完全抗原和山羊抗小鼠IgG包被于NC膜上，分別作為T線和C線。按照圖1，組成膠體金試劑條。

1樣品墊;2結(jié)合墊;3NC膜;4吸水墊;5PVC底板圖1 試紙條側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.2 真菌毒素免疫膠體金層析法試劑條的質(zhì)量驗(yàn)證

(1) 真菌毒素膠體金檢測試劑條檢測限度的測定。取玉米糝2.0 g 15份，分別加入不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0、2.5、5.0、10和20 ng/g，每個濃度做3次重復(fù)。通過消線法判定結(jié)果，確定試劑條檢測限度。

(2) 與結(jié)構(gòu)類似物的特異性試驗(yàn)。用含15%甲醇的PBS緩沖液分別將真菌毒素結(jié)構(gòu)類似物AFM1、AFB2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米赤霉醇制備成濃度為1.0、5.0、100和500ng/ml的溶液，用試劑條進(jìn)行檢測。

(3)實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜法(HPLC)一致性評價。參照食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布的《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》(食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號)方法[5]，與實(shí)驗(yàn)室儀器HPLC方法進(jìn)行產(chǎn)品的靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率、一致性分析?？ǚ綑z驗(yàn)統(tǒng)計分析顯著性差異(χ2)。方法如表1所示。

表1 真菌毒素免疫膠體金層析法

2 結(jié)果

2.1 檢測限的確定

玉米糝中AFB1加入濃度為2.5 ng/g時，結(jié)果顯示陰性，而加入5.0 ng/g及以上濃度時，結(jié)果為陽性，說明樣品檢測限為5.0 ng/g。所有檢測項目重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果均一致，檢測限滿足國標(biāo)要求。

表2 試驗(yàn)結(jié)果

2.2 與結(jié)構(gòu)類似物特異性試驗(yàn)

試紙條檢測濃度小于靈敏度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品時，結(jié)果為陰性，檢測濃度大于等于靈敏度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品時，結(jié)果為陽性;檢測不同濃度的真菌毒素結(jié)構(gòu)類似物，結(jié)果均為陰性，表明試紙條的特異性較好。

2.3 實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜法(HPLC)一致性評價

本研究中的真菌毒素檢測試劑條同實(shí)驗(yàn)室HPLC法比較，靈敏度99%，特異性97%，假陰性率為1%，假陽性率為3%，χ2=0.25，和實(shí)驗(yàn)室HPLC法無顯著性差異。各個性能指標(biāo)滿足國家關(guān)于快檢國標(biāo)的技術(shù)參數(shù)要求。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3 討論

本研究中的真菌毒素檢測試劑條靈敏度高，達(dá)到符合國標(biāo)要求的檢測限值。與真菌毒素類似物無交叉反應(yīng)，特異好。同實(shí)驗(yàn)室HPLC法比較，靈敏度99%，特異性97%，假陰性率為1%，假陽性率為3%，卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計分析，χ2=0.25，和實(shí)驗(yàn)室HPLC法無顯著性差異。各個性能指標(biāo)滿足國家關(guān)于快檢國標(biāo)的技術(shù)參數(shù)要求，具有良好的應(yīng)用前景。