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云南省大理州鶴慶縣，位于云南省西北部，大理白族自治州北端，東經(jīng)100。01′～ 100。29′、北緯25。57′ ～26。42′.滇西橫斷山脈南端、云嶺山脈以東，東有金沙江與永勝縣分津，南與賓川縣接界，西與劍川縣、洱源縣接壤，北與麗江市毗連?？?cè)丝?7萬，有白、漢、彝、傈僳、苗、壯、納西等22個(gè)民族，其中白族占總?cè)丝诘?6.76%。鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村委會(huì)距縣城28公里，平均海拔2900米，屬高寒特困山區(qū)，全村轄18個(gè)村民小組，農(nóng)戶676戶2 986人，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要以種植馬鈴薯。

鶴慶縣于1772-1772年、1778-1796年、1879-1888年在東區(qū)(松桂、南莊、朵美、馬耳山)有過3次較大的鼠疫流行。1888年后無流行報(bào)道[1]，已靜息128年。1985年在馬廠村(大馬廠)、新蜂村(小馬廠)狗血清和鼠血清中發(fā)現(xiàn)放射免疫陽性4份，1990年后開始每月在新蜂、馬村進(jìn)行鼠疫監(jiān)測(cè)。2017年4月16日鶴慶縣CDC鼠防人員在草海鎮(zhèn)馬廠村進(jìn)行鼠疫常規(guī)監(jiān)測(cè)時(shí)，用鼠籠捕獲87只活鼠，通過解剖培養(yǎng)，其中2只鼠的肝、脾培養(yǎng)有疑似鼠疫菌菌落，送云南省地方病防治所復(fù)判，經(jīng)過四步診斷、菌落PCR、免疫學(xué)等常規(guī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為鼠疫菌陽性，據(jù)此判定在鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠有鼠間鼠疫流行。為了進(jìn)一步確定鶴慶縣鼠間鼠疫流行強(qiáng)度和范圍，于2017年4月24日至5月28日組織省、州、縣3級(jí)專業(yè)機(jī)構(gòu)聯(lián)合調(diào)查組對(duì)鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村及周邊進(jìn)行鼠疫擴(kuò)大調(diào)查。

1 材料與方法

1.1調(diào)查范圍 此次調(diào)查主要以草海鎮(zhèn)馬廠行政村(大馬廠、竹蘭井、黑泥紹)為中心，向周圍的新蜂行政村(小馬廠)、安樂行政村(安樂、沙子坪)放射狀調(diào)查，方圓5公里范圍。

1.2調(diào)查方式 主要通過入戶訪問，在村中和村周搜尋自死鼠，采集狗血清，用鼠籠捕獲嚙齒動(dòng)物，所獲材料進(jìn)行血清學(xué)、病原學(xué)檢測(cè)。

1.3鼠蚤鑒定 鼠及鼠體蚤用乙醚熏蒸后進(jìn)行分類鑒定。

1.4活鼠健康狀態(tài)及解剖病變觀察 解剖前通過視覺對(duì)活鼠的神態(tài)、反應(yīng)、活動(dòng)、毛色等情況進(jìn)行觀察，判斷健康狀態(tài)；解剖時(shí)對(duì)皮下、淋巴結(jié)、胸腹腔積液、心、肺、肝、脾等病變情況進(jìn)行觀察。

1.5免疫學(xué)檢測(cè) 用真空采血器采集狗血5 mL，活鼠股動(dòng)脈放血，二者分別離心，分離血清做F1抗體檢測(cè)；活鼠解剖取肝、脾，自死鼠取鼠鼷腺、心、肺、肝、脾、骨髓做F1抗原檢測(cè)?？乖⒖贵w初篩檢測(cè)陽性者均做三排復(fù)試(正反向血凝試劑盒，批號(hào) 20170201，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn))。

1.6病原分離 活鼠取肝、脾分別接種在選擇敏感培養(yǎng)基(批號(hào)20160813，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn))，置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察3 d；蚤按三同(同地點(diǎn)、同鼠種、同蚤種)拉胃碾磨接種在選擇敏感培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)觀察5 d，發(fā)現(xiàn)可疑菌落，做兩種溫度(15 ℃、37 ℃)噬菌體裂解試驗(yàn)(鼠疫菌診斷用鼠疫噬菌體(批號(hào) 20161102)，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn))，鼠疫菌判定按鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1檢診檢疫及自死鼠調(diào)查 5月1日-5月15日，通過一類及二類地區(qū)入戶訪問，共入戶1 428戶6 557人的接受調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)原因不明的高熱病人和急死病人，同時(shí)全縣醫(yī)療衛(wèi)生單位訪問了門診病人32 475人，排查發(fā)熱病人533均未發(fā)現(xiàn)鼠疫疑似病人。4月23-30日，每天在大馬廠、小馬廠、竹蘭箐、黑泥哨、新峰、安樂、沙子坪等村耕地及居民區(qū)巡查，投入專業(yè)人員455次、捕鼠員18人次、滅鼠員96次，踏查面積58 500畝，未搜尋到自死鼠、病鼠。

2.2流行范圍 鶴慶此次流行病學(xué)調(diào)查了1個(gè)鎮(zhèn)3個(gè)行政村6個(gè)自然村，查明鼠間鼠疫僅僅在草海鎮(zhèn)馬廠村委會(huì)大馬廠自然村外100米耕地流行，方圓1公里左右。

2.3宿主及媒介 本次調(diào)查共有小型獸類2目3科5種，其中嚙齒動(dòng)物2科3屬4種：大絨鼠(Eothenomysmiletus)，齊氏姬鼠(Apodemuschevrieri)，黃胸鼠(Rattusflavipectus)，社鼠(Rattusniviventer).食蟲目有1科1屬1種：臭鼩鼱(Suncus.murinus)。 本次調(diào)查主要媒介蚤類3科5屬5種，分別為：方葉櫛眼蚤(Ctenophthalmusquadrarus)，特新蚤指名亞種(Neopsyllaspecialisspecialis)，棕形額蚤(Frontopsyllaspadix)，緩慢細(xì)蚤(Leptopsyllasegnis)，不等單蚤(Monopsyllusanisus)。

共捕獲354只活鼠，其中大絨鼠257只(72.6%)，齊氏姬鼠29只(8.2%)，其它19.2%。共分離鼠體蚤242匹，其中方葉櫛眼蚤181匹(74.8%)，特新蚤指名亞種27匹(11.2%)，其它34匹(14.0%)。從生境上看，在耕地共捕獲活鼠292只，其中大絨鼠257只(88.0%)，齊氏姬鼠29只(9.93%)，黃胸鼠4只(1.4%)，社鼠2只(0.6%)；而居民區(qū)捕獲62只活鼠，其中黃胸鼠50只(80.6%)，臭鼩鼱9只(14.5%),社鼠3只(4.8%)(詳見圖1)。

在活鼠上共檢獲蚤242匹，其中野鼠染帶蚤212匹，其組成為方葉櫛眼蚤181匹(85.4%)，特新蚤指名亞種27匹(12.7%)，棕形額蚤3匹(1.4%)，不等單蚤1匹(0.47%)；居民區(qū)鼠染帶蚤30匹，其中緩慢細(xì)蚤18匹(60%)，不等單蚤8匹(26.7%)，棕形額蚤2匹(6.7%)，特新蚤指名亞種2匹(6.7%)(見圖2)。

圖1 鶴慶縣耕地和居民區(qū)宿主動(dòng)物組成圖Fig.1 The composition of the rodents in the cultivated land and the residential area of Heqing County

圖2 鶴慶縣耕地和居民區(qū)媒介組成圖Fig.2 The composition of the vectors in the cultivated land and the residential area of Heqing County

2.4活鼠健康狀態(tài)及解剖病變觀察 捕獲鼠均為活鼠，從外觀上觀察，活動(dòng)自如，兩眼有神，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光亮，處于健康狀態(tài)；解剖病變觀察：皮下微充血，鼠鼷腺無腫大，胸腔、腹腔有少量紅色積液，心、肺、肝、脾顏色正常，無腫大、無結(jié)節(jié)、無壞死。

2.5免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果 共采集狗血清92份，鼠血清4份，血清F1抗體檢測(cè)結(jié)果陰性，354只活鼠取肝、脾做F1抗原檢測(cè)，陽性3份，其中肝脾抗原檢測(cè)陰性材料中2份(32號(hào)、112號(hào))細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)為鼠疫菌陽性(見表1)。

表1 2017年云南鶴慶分離鼠疫菌信息表
Tab.1 Information of Yersinia pestis strains isolated from Heqing, Yunnan in 2017

菌株號(hào)分離地點(diǎn)宿主及媒介狀態(tài)分離時(shí)間噬菌體試驗(yàn)反向血凝試驗(yàn)16北坡腳大絨鼠活2017.4.16陽性ND21北坡腳大絨鼠活2017.4.16陽性ND32北坡腳齊氏姬鼠活2017.4.24陽性-112西坡腳大絨鼠活2017.4.28陽性-146西坡腳大絨鼠活2017.4.28陽性1∶1280++153西坡腳特新蚤指名亞種活2017.4.28陽性ND161西坡腳大絨鼠活2017.4.28陽性1∶1280++164西坡腳大絨鼠活2017.4.28陽性1∶81920++125西坡腳特新蚤指名亞種活2017.5.1陽性ND139西坡腳方葉櫛眼蚤活2017.5.1陽性ND

2.6細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果 共捕獲到活鼠354只，分離鼠疫菌7株，陽性率2.0%，其中自大絨鼠中分離到6株，陽性率1.7%；齊氏姬鼠中分離到1株，陽性率0.3%。鼠染帶蚤242匹，分離到鼠疫菌3株，陽性率為1.2%，其中特新蚤指名亞種2株，陽性率0.8%，方葉櫛眼蚤1株，陽性率0.4%?？傊?，此次從活鼠及染帶蚤共分離到10株鼠疫菌, 均分離自鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村(見表1)；部分菌株28 ℃噬菌體裂解圖見圖3。

圖3 16號(hào)與21號(hào)在28 ℃下噬菌體裂解圖Fig.3 Phage lysate figure of sample 16 and 21 at 28 ℃

3 討 論

3.1鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村鼠疫流行性質(zhì) 從宿主、媒介調(diào)查結(jié)果上看與相鄰縣劍川、麗江野鼠鼠疫疫源地相似；對(duì)分離的鼠疫菌進(jìn)行分子生物學(xué)和生化鑒定(行分子生物學(xué)和生化鑒定結(jié)果另文處理)，鶴慶縣鼠疫菌株為野鼠鼠疫菌。因此本次鼠疫流行初步認(rèn)為是以大絨鼠、齊氏姬鼠為主要宿主，特新蚤指名亞種為主要媒介的野鼠鼠疫流行[2-3]。

3.2 鶴慶縣鼠疫流行特征

3.2.1與云南家、野兩型疫源地菌株檢出對(duì)象的差異 鶴慶縣與劍川縣鼠疫流行的表現(xiàn)形式差異較大，劍川1974年發(fā)現(xiàn)指示動(dòng)物血清陽性，1975年從一只自死小林姬鼠分離到鼠疫菌[4]，其后1981-1991、1994、1997年從自死動(dòng)物中分離到鼠疫菌，活鼠中均無發(fā)現(xiàn)[5]。麗江2005發(fā)生了嚴(yán)重的人間鼠疫流行，在隨后調(diào)查的1 762份鼠類樣本中除在27份自死鼠檢測(cè)到3份鼠疫菌，其余均為陰性[3]，2006-2017年麗江發(fā)生多次野鼠鼠疫流行，期間也進(jìn)行過大范圍疫源調(diào)查，同樣沒有從活鼠中分離到鼠疫菌[6-8]，就連菌株毒力相對(duì)低一些的云南家鼠鼠疫1982年復(fù)燃以來，1000多個(gè)鼠疫疫點(diǎn)，絕大多數(shù)都是從自死鼠分離到鼠疫菌[9-11]，在鼠疫流行期間進(jìn)行大量調(diào)查中，至今沒有看似健康的動(dòng)物體分離到鼠疫菌[3]，在幾十年鼠疫常規(guī)監(jiān)測(cè)及鼠疫流行好發(fā)季節(jié)的疫源調(diào)查均沒有從活鼠中分離過鼠疫菌。然而就是在鼠疫工作者認(rèn)為不可能的情況下，鶴慶縣CDC在2017年4月16日進(jìn)行鼠疫常規(guī)監(jiān)測(cè)時(shí)，在用鼠籠捕獲的87只活鼠中分離到鼠疫菌2株。其后開展了調(diào)查工作，在267只活鼠中再次分離到鼠疫菌5株，在鼠疫流行區(qū)及周邊始終沒有找到自死鼠和病鼠。

3.2.2鼠疫在活鼠間流行 鶴慶縣CDC在常規(guī)監(jiān)測(cè)中于2017年4月16日馬廠北坡腳大絨鼠中檢出2株鼠疫菌株，調(diào)查過程中又在4月24日馬廠北坡腳齊氏姬鼠中分離鼠疫菌1株，28日馬廠西坡腳分離4株，5月1日從媒介分離2株。從分離鼠疫菌時(shí)間上看鼠疫在不斷蔓延，并波及大絨鼠和齊氏姬鼠2個(gè)種群，寄生蚤特新蚤指名亞種分離到鼠疫菌，說明完全具備了鼠疫在鼠間傳播的條件[2-3]。因此，鶴慶縣鼠疫并非是單純的在自然界中存在被偶然發(fā)現(xiàn)，而是在局部范圍內(nèi)活鼠之間以流行的方式延續(xù)。這種能在活鼠間流行的方式是鼠疫流行的新發(fā)現(xiàn)，但能否在自然界中長(zhǎng)期存在不得而知(因疫情處置使本次鼠疫流行終止)。假設(shè)這種能在活鼠間流行的方式長(zhǎng)期得以延續(xù)，那么將會(huì)為長(zhǎng)期困惑鼠疫工作者鼠疫的保存機(jī)制研究打開一扇窗。

3.2.3鼠疫菌對(duì)宿主的致病性較弱 鶴慶縣在本次鼠疫流行區(qū)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)中并沒有發(fā)現(xiàn)有自死鼠和病鼠現(xiàn)象，此次大范圍搜尋同樣沒有發(fā)現(xiàn)，這與云南家野兩型鼠疫流行時(shí)出現(xiàn)大量自死鼠完全不同[6-11]。甚至對(duì)捕獲鼠的健康觀察沒有發(fā)現(xiàn)帶病跡象，解剖觀察，胸、腹腔僅有少量積液，臟器病變也不典型。說明鶴慶縣鼠疫流行菌株對(duì)宿主動(dòng)物的致病性較弱，只能形成輕微的菌血癥，這在解剖培養(yǎng)時(shí)觀察視野菌落比較稀少得到佐證。

3.3鼠疫菌免疫學(xué)的特殊表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)時(shí)有2份臟器出現(xiàn)異常結(jié)果，反向血凝F1抗原檢測(cè)陰性，細(xì)菌檢測(cè)則為陽性(32、112)，用分離鼠疫菌(32、112)做反向血凝F1抗原檢測(cè)則為陽性，這在其他鼠疫流行時(shí)期和動(dòng)物試驗(yàn)中極少出現(xiàn)這種現(xiàn)象。通常反向血凝陽性檢出率要高于細(xì)菌檢出率[12]。有學(xué)者研究出現(xiàn)這樣的結(jié)果是因?yàn)镕1抗原在活鼠表達(dá)受抑制，一旦感染鼠死亡，則大量釋放，用免疫學(xué)方法才可以檢測(cè)出結(jié)果[13]。

3.4鶴慶縣鼠疫流行對(duì)鼠疫防治工作的啟示 1975年劍川縣野鼠鼠疫疫源地的確立，1982年德宏州家鼠鼠疫的復(fù)燃，針對(duì)鼠疫防治工作政府出臺(tái)了許多政策和防治措施，對(duì)鼠疫的防治起到了關(guān)鍵作用，1982-2017年期間雖然發(fā)生多起鼠疫流行事件，但每次都得到有效控制，歷史悲劇沒有重演，然而在長(zhǎng)期鼠疫防治和監(jiān)測(cè)工作中，有許多鼠疫工作者甚至鼠疫專家都認(rèn)為鼠疫的發(fā)現(xiàn)主要是靠自死鼠或病鼠，常規(guī)監(jiān)測(cè)是很難發(fā)現(xiàn)鼠疫流行的，基于這樣的考慮，鼠疫監(jiān)測(cè)任務(wù)逐年下降，單位鼠防人員配置減少，專業(yè)人員對(duì)活鼠的檢驗(yàn)不夠重視等現(xiàn)象，鶴慶縣活鼠間鼠疫流行的發(fā)現(xiàn)給我們提出警示，鼠疫是可以在不致死宿主動(dòng)物的情況下在活鼠間流行，同時(shí)細(xì)菌數(shù)量少，F(xiàn)1抗原含量低，如果工作中不認(rèn)真，不仔細(xì)，就容易漏診，因此應(yīng)扭轉(zhuǎn)鼠防人員對(duì)活鼠在鼠疫流行發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)低的認(rèn)識(shí)，在鼠疫流行相對(duì)靜息時(shí)期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)活鼠的監(jiān)測(cè)，拓寬對(duì)活鼠的檢驗(yàn)類別，提高鼠防人員的責(zé)任心，以免漏診。

(云南省衛(wèi)計(jì)委陸林，云南省地方病防治所左仕富、高子厚、劉正祥、李玉瓊、蘇超、段興德、浦恩念、吳鶴松等，大理州疾病預(yù)防中心羅建龍、陳建萍，張鏡蘭，大理市疾控中心余杰，洱源縣疾控中心楊劉佳，祥云縣疾控中心謝華敏，指導(dǎo)及參加了本次調(diào)查，在此表示感謝!)