潘朋歌,李克生,杜惠芬,曾潮寧

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室/寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室，寧夏銀川 750004；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730050;3.蘭州雅華生物技術(shù)有限公司，甘肅蘭州 730050)

柯薩奇病毒(coxsackie virus,CV)屬于小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬，可導(dǎo)致多種人類疾病，如呼吸道感染、手足口病、結(jié)膜炎、皰疹性咽頰炎、發(fā)熱性皮疹、心肌炎、急性弛緩性麻痹及腦炎等[1-2]?？滤_奇病毒被分為A、B兩組，其中 A組16型(CVA16)作為引起兒童手足口病的主要腸道病毒之一而備受關(guān)注[3]。

CVA16為無包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組只含有1個開放讀碼框，編碼產(chǎn)生一個相對較長的多聚蛋白前體，經(jīng)蛋白酶水解形成P1、P2、P3這3個功能區(qū)，其中P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4，構(gòu)成病毒衣殼，而P2、P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。當(dāng)病毒感染宿主細胞時，VP1蛋白與細胞上的受體結(jié)合導(dǎo)致VP4釋放，進而使得病毒基因組進入細胞。此外，CVA16的中和抗原決定簇大多位于VP1功能區(qū)，且VP1基因與腸道病毒血清型相對應(yīng)，可作為CVA血清型或腸道病毒屬內(nèi)不同血清的分類依據(jù)[5-7]。雖然VP1蛋白被作為研究CVA16的主要目標(biāo)而被廣泛關(guān)注，但是目前對CVA16 VP1免疫性方面的研究仍然較少。該研究將CVA16VP1全基因克隆到原核表達載體pET30a，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1，原核表達并純化 CVA16 VP1，以期為CVA16診斷試劑開發(fā)和疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、表達質(zhì)粒pET30a由寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室保存；序列合成與測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.2工具酶及主要試劑。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ/XhoI、T4DNA連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自TaKaRa公司；DNA Marker、蛋白Marker購自Fermentas公司；卡那霉素、氨芐青霉素等為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；猴抗 CVA16 血清購自 ATCC；HRP 標(biāo)記的羊抗猴 IgG 購自 Sigma 公司;鎳金屬鰲合層析柱購自Pharmacia公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1的構(gòu)建。根據(jù)GenBankCVA16VP1基因序列，對目的基因進行密碼子優(yōu)化，按照優(yōu)化后的基因序列，人工合成CVA16VP1全基因，共891 bp，同時在CVA16VP1基因5’端引入Hind Ⅲ酶切位點，3′端刪除終止密碼子引入XhoⅠ酶切位點。合成的CVA16VP1基因和表達載體pET30a分別用Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切，酶切完全后回收目的載體和片段，按一定比例(1∶3～1∶5)混勻，加入等體積T4DNA連接酶，16 ℃過夜連接。采用熱激法將上述連接液轉(zhuǎn)化至新鮮制備的E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上于37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2重組質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1的鑒定。挑取平板上的單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含有卡那霉素)中，37 ℃搖菌過夜，按照質(zhì)粒小提試劑盒的操作說明提取質(zhì)粒DNA。以該質(zhì)粒DNA為模板，用pET30a的通用引物T7/T7 terminator進行PCR擴增，PCR條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小正確的陽性質(zhì)粒送測序，將測序結(jié)果與密碼子優(yōu)化后的VP1基因序列比對以確定插入序列的正確性。

1.2.3融合蛋白CVA16-VP1的誘導(dǎo)表達。將測序正確的重組質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1轉(zhuǎn)化到感受細胞E.coliBL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化細胞涂于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平皿中，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。隨機挑取陽性克隆到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0，次日按1∶50～1∶100的比例接種到300 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0，取出1 mL未誘導(dǎo)菌作為陰性對照，4 ℃暫存。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體。按0.1 g/mL向菌體沉淀中加入PBS緩沖液，充分混勻，-70 ℃反復(fù)凍融3～4次，冰浴超聲破碎至溶液透明，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清。向沉淀中加入適量2 mol/L的尿素溶液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.5 mol/L NaCl；2 mol/L尿素；2% Triton)重懸，室溫靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清；重復(fù)上述步驟1次；最后加入包涵體溶解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.5 mol/L NaCl；8 mol/L尿素；0.2 mmol/L DTT；2% Triton)重懸，4 ℃充分溶解。分別將未誘導(dǎo)的菌液、誘導(dǎo)后的菌液、上清及尿素洗滌后的樣品處理后進行SDS-PAGE分析。

1.2.4重組蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)性及純化。將8 mol/L尿素溶解后的樣品，通過Sephacryl S-300凝膠層析進行結(jié)構(gòu)復(fù)性，柱床規(guī)格20 mm×400 mm ， 0.01 mmol/L 7.4 PBS、0.25 mL/min 流速洗脫，收集主蛋白峰；Ni-NTA親和層析純化，咪唑梯度洗脫，收集目的蛋白。pH 8.0 Sephacryl S-300凝膠柱脫鹽，超濾離心，濃縮抗原。SDS-PAGE分析抗原純度，紫外分光光度計測定蛋白濃度。

1.2.5純化產(chǎn)物的Western Blot 鑒定。將純化的重組CVA16 VP1 蛋白經(jīng) SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素膜上，加入 5%脫脂奶粉，室溫封閉 1 h；PBST緩沖液沖洗，加入1∶2 000 稀釋的猴抗 CVA16 血清，室溫孵育 1 h；PBST緩沖液沖洗，再加入 HRP 標(biāo)記的羊抗猴 IgG(1∶2 000 稀釋)，室溫孵育 1 h；PBST 緩沖液洗膜，最后加 TMB顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1的鑒定重組質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1經(jīng)pET30a通用引物T7/T7 terminator擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測可觀察到一條約1.3 kb的條帶，與理論值相符；進一步的測序結(jié)果顯示，基因序列與密碼子優(yōu)化后的序列一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果如圖1。

注：M.DL 2000 Marker;1,2.重組質(zhì)粒的PCR鑒定產(chǎn)物Note:M.DL2000 DNA Marker;1,2.PCR identification of pET30a-CVA16-VP1圖1 pET30a-CVA16-VP1重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 The identification of recombinant plasmid pET30a-CVA16-VP1

2.2重組蛋白CVA16-VP1的誘導(dǎo)表達將重組表達質(zhì)粒pET30a-CVA16-VP1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株BL21(DE3) 中，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，成功表達出VP1蛋白，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體未見表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，其分子量大約為38.7 kDa，與預(yù)期值相符(圖2：1～2)。目的蛋白在細胞中以包涵體的形式存在(包涵體經(jīng)洗滌、溶解，8 mol/L尿素時可看到有大量目的蛋白析出)(圖2：3～7)。

注：M.蛋白Marker;1.pET30a-CVA16-VP1轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo);2.pET30a-CVA16-VP1轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo);3.破碎后上清;4.破碎后沉淀;5. 2 mol/L尿素洗滌;6. 2 mol/L尿素二次洗滌;7. 8 mol/L尿素溶解包涵體Note:M.Protein Marker;1.pET30a-CVA16-VP1 tansformed E.coli,not induced;2.pET30a-CVA16-VP1 tansformed E.coli induced with IPTG;3.The supernatant after sonication;4.The precipitation after sonication;5. 2 mol/L Urea;6.Secondary 2 mol/L Urea;7. 8 mol/L Urea圖2 重組蛋白CVA16-VP1在E.coli中表達的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein VP1 expressed in E.coli induced by IPTG

2.3重組蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)性及純化8 mol/L尿素溶解液經(jīng)Sephacryl S-300凝膠層析進行結(jié)構(gòu)復(fù)性和Ni-NTA親和層析柱親和層析純化，獲得了純度約90%的目的蛋白，結(jié)果見圖3。紫外分光光度法測蛋白濃度，蛋白濃度達2 mg/mL。

注：M.蛋白質(zhì)Marker；1.純化的CVA16-VP1重組抗原Note:M.Protein Marker; 1.Purified VP1 recombinant antigen圖3 純化的CVA16-VP1重組抗原SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE of purified VP1 recombinant antigen

2.4重組蛋白VP1的WesternBlot測定將純化后的重組蛋白VP1與猴抗 CVA16 血清進行Western Blot分析，顯色后在硝酸纖維膜上出現(xiàn)單一條帶(圖4)，表明表達的重組蛋白即為VP1蛋白。

注：1.陰性對照；2.純化的重組蛋白Note:1.Negative control；2.Purified VP1圖4 純化蛋白的Western Blot分析Fig.4 Western blotting of purified VP1

3 討論

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是一種全球性的急性兒科傳染病，主要由腸道病毒71型(EV71)和CVA16 引起[8]。EV71在HFMD的流行中一直占主要地位，部分急性患者可引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡[9]；而CVA16的感染癥狀較為輕微[3]，因此在過去的數(shù)十年EV71一直是研究的重點，CVA16常被忽略。目前EV71滅活疫苗已經(jīng)成功上市[10]，但這些疫苗對CVA16感染導(dǎo)致的手足口病是沒有交叉保護作用的[11-12]。近些年又有研究發(fā)現(xiàn)，CVA16感染的患者在重癥階段同樣可引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡[7]，不同的是患者年齡更小，而且CVA16的感染往往反復(fù)，致使患兒持久不愈[13-14]。因此，目前對于CVA16的研究就顯得尤為重要，而VP1 作為CVA6 主要外膜蛋白之一和抗原區(qū)的一部分，成為CVA6疫苗和臨床診斷試劑研究良好的候選抗原。

該試驗成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒 pET30a -CVA16-VP1，并轉(zhuǎn)入表達菌株E.coliBL21(DE3)中進行優(yōu)化表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，證明VP1蛋白在大腸桿菌中成功表達并主要以包涵體形式存在，表達蛋白經(jīng)復(fù)性、純化，純度達90%以上；Western Blot證實表達的重組蛋白即為VP1，為此抗原的臨床診斷應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。