唐藝丹 劉一辰 呂佰陽 郭路路 李冰凌

摘 要 核酸等溫擴增技術作為核酸體外擴增技術，其反應過程始終維持在恒定溫度下。與聚合酶鏈反應相比，核酸等溫擴增反應具有優(yōu)異的便攜型，因而被視為最有望實現(xiàn)基因快檢甚至即時快檢的體外基因擴增方法。然而，由于反應過程中假陽性擴增頻發(fā)、反應后對產(chǎn)物的檢測方法缺乏特異性和靈敏度等缺點，限制了其在實際分析檢測中的應用。通過構建發(fā)卡型結構萬能中轉探針，成功地將恒溫擴增產(chǎn)物轉到一套性能良好的已知核酸分子線路上；借助核酸分子線路的百倍放大性能和序列特異性，實現(xiàn)對上游基因序列信息的精準識別和放大信號輸出。針對不同的待測序列，僅需改變發(fā)卡型中轉探針的序列，即可實現(xiàn)對不同序列目標物的檢測?；谥修D探針的重要性，本研究對中轉探針的設計原理和方法進行了重點闡述，提出并驗證了一套行之有效的普適性設計規(guī)律，確保中轉探針良好的中轉效率（信噪比）。利用這一規(guī)律獲得的中轉探針，與核酸分子線路偶聯(lián)，可成功為低至近單分子（20個拷貝）的模型基因提供顯著熒光和電化學信號輸出。

關鍵詞 等溫擴增； 萬能中轉； 發(fā)卡型中轉探針； 核酸分子線路； 催化發(fā)卡型結構自組裝； 熒光； 電化學

1 引 言

基因診斷是應用分子生物學技術對病患特定基因片段進行定量或定性分析的檢測方法。由于病原體基因含量通常極低，因此對基因片段進行高效擴增，是對其進行識別和分析的首要步驟。目前，以聚合酶鏈反應（PCR）為代表的熱循環(huán)核酸擴增反應和一系列恒溫擴增反應，被認為是功能最為強大的核酸擴增體系。恒溫擴增反應包括滾環(huán)放大（RCA）[1]、自主序列復制擴增（3SR）[2]、依賴于核酸序列擴增（NASBA）[3]、鏈替換擴增（SDA）[4]、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）[5]、解旋酶替換擴增（HAD）[6]、重組酶復制擴增（RPA）[7]等。在這一系列等溫擴增技術中，日本Eiken Chemical公司于2000年發(fā)明了LAMP技術[5]（圖1，STEP I），使用一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶和4條特征性引物，可在恒定溫度（（65±5）℃）下實現(xiàn)對雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA模板序列的109～1010倍擴增。因此，該技術自發(fā)明以來一直被視為PCR最有力的競爭者和最具即時診斷（POC）兼容性的恒溫擴增技術。盡管如此，LAMP的實際應用依然受到“可靠性低”的嚴重制約[8～13]。原因是在恒溫條件下，核酸擴增反應失敗率（假陰性）和非特異性（假陽性）激增；而目前普遍使用的表征方法（如凝膠電泳、熒光染色、共沉淀、雙引物標記比色法等）僅能識別堿基對的增加，并不能有效辨別正確的擴增序列，易發(fā)生誤診和漏診。這也是目前阻礙各種恒溫擴增技術廣泛應用的主要因素。

無酶核酸分子線路是通過控制核酸鏈交換反應的動力學性質而建立的核酸分子工程新方向[14～18]，該理論證明單個或多個單鏈DNA輸入存在下可引發(fā)一系列并聯(lián)或串聯(lián)的鏈交換反應，實現(xiàn)線性或指數(shù)循環(huán)放大效果，且整個過程不需要任何蛋白質輔助。最具代表性的無酶分子線路包括雜交鏈反應（Hybridization chain reaction，HCR）[19，20]。 熵驅動反應（Entropy driven reaction）[21]和催化發(fā)卡型結構自組裝（Catalytic hairpin assembly，CHA）反應[22，23]。在CHA反應中，一條線性DNA輸入（C1）通過兩次核酸鏈交換依次打開并組裝兩條序列互補、但雜交受限的發(fā)卡型DNA（H1和H2）；每完成一次組裝，C1可自發(fā)脫離組裝體（H1-H2），作為催化劑再次參與另一次組裝過程[23]。相比于一步鏈交換，CHA明顯的優(yōu)勢在于具有50～100倍放大功能；信噪比高，可程序化；對錯配響應更加靈敏和特異；產(chǎn)物簡單且?guī)в袉捂?，可靈活、簡便地偶聯(lián)到下游熒光、電化學和比色等常規(guī)檢測器中[23]。基于上述獨特優(yōu)勢，CHA已作為新一代的信號放大和傳感元件被用于多種分析應用中[24～27]。

在前期工作中，本課題組已證明將CHA作為LAMP擴增反應與下游信號輸出間的智能傳導元件，能夠克服上述LAMP假性信號頻發(fā)的缺點和不足[12，28]。LAMP擴增后的環(huán)狀單鏈產(chǎn)物一般含有25～35個堿基，可將其直接作為催化劑C1設計CHA的反應組分H1、H2和F-Q報告探針。CHA的特征性傳導可以精準地識別待測序列，在完全排除假陽性誤診的前提下進一步放大信號幅度，降低假陰性檢出率。然而，該方法在檢測新的待測基因時需重新設計CHA組分和反應，過程繁瑣復雜。由于大多數(shù)基因片段含有自折疊二級結構，使得CHA反應的高效性也難以保證。本研究以提高方法普遍適用性為目的，提出基于“發(fā)卡結構探針”的“萬能傳導”策略[12]。其主旨是將一套高效CHA反應的C1封閉在發(fā)卡型中轉探針的莖部，使其無法誘導CHA反應；只有當中轉探針被LAMP環(huán)狀產(chǎn)物打開時，C1才被游離出來，開啟有效的CHA反應。利用這種策略，檢測方式由直接檢測LAMP產(chǎn)物轉變?yōu)闄z測一套高效CHA的C1；因此針對不同的待測序列，只需更換發(fā)卡型中轉探針即可實現(xiàn)檢測。雖然此方法的可行性已在前期工作中得到驗證，但后續(xù)研究表明，發(fā)卡型探針的設計過程復雜且失敗率高； 打開率低或封閉效率低的發(fā)卡探針會嚴重影響后續(xù)CHA對LAMP產(chǎn)物的檢測結果，信噪比無法達到預期水平。因此，本研究將對發(fā)卡型探針的設計和優(yōu)化方法進行詳細討論，總結出一套行之有效的設計規(guī)律，從而實現(xiàn)CHA對基因的超靈敏、超特異和超普適分析。經(jīng)過優(yōu)化，實現(xiàn)了對模型基因（大腸桿菌的malB基因片段）的超特異檢測，檢測限低至20個拷貝，完全滿足實際需求。

實驗中所使用的緩沖液包括：1 × TNaK 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5），含140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl； 1 × 等溫擴增緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.8），含10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20；電解質緩沖溶液I-Buffer（pH 7.4）：10 mmol/L Tris-HCl溶液、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl；實驗用水為超純水（四川沃特爾水處理設備有限公司超純水機制備）。

2.2 實驗方法

2.2.1 發(fā)卡型中轉探針-CHA反應檢測 不同濃度模擬LAMP產(chǎn)物（Target和Target 2）配制體系為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20、甜菜堿終濃度為1 mol/L。取12 μL Target或Target 2加入22.2 nmol/L 中轉探針（Transducer），退火5 min（即95℃孵育5℃后，以0.1℃/min 降溫至37℃）。以1∶1∶1∶1的體積比加入Target-Transducer混合物、200 nmol/L H1、800 nmol/L H2、200 nmol/L報告基因（包括200 nmol/L F和400 nmol/L Q）。反應液中Mg2+終濃度為5 mmol/L。

2.2.2 LAMP等溫擴增反應 以帶有目標基因的質粒為模板進行擴增，25 μL LAMP反應體系為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L （NH4）2SO4、50 mmol/L KCl、4 mmol/L MgSO4、0.1% Tween 20，其中內引物FIP/BIP濃度為0.8 μmol/L，外引物F3/B3濃度為0.2 μmol/L，甜菜堿濃度為1 mol/L，dNTPs終濃度為0.4 mmol/L，將24 μL混合液退火5 min，最后加入1 μL（120 U）Bst 2.0 DNA聚合酶。反應溫度為65℃，反應時間為90 min，最后80℃熱處理20 min 終止反應。

2.2.3 LAMP-發(fā)卡型中轉探針-CHA反應檢測 在12 μL LAMP反應物中加入終濃度為20 nmol/L Transducer 3，95℃退火5 min，以1∶1∶1∶1的體積比加入LAMP擴增子-Transducer 3混合物、200 nmol/L H1、800 nmol/L H2、200 nmol/L報告基因（包括200 nmol/L F和400 nmol/L Q）。反應液中Mg2+終濃度為5 mmol/L。

2.2.4 電化學檢測 電化學檢測實驗中所用電極為新型PEG（Plastic-gold electrode）芯片電極[29]，三電極均為金電極的體系。電極以0.1 mol/L H2SO4清洗后，修飾HS-P巰基探針，并用MCH進行封閉。在12 μL LAMP反應物中加入終濃度為20 nmol/L Transducer 3，95℃退火5 min，以1∶1∶1∶1的體積比加入LAMP擴增子-Transducer 3混合物、800 nmol/L H1-MB、800 nmol/L H2和緩沖溶液。在37℃反應2 h后，將20 μL溶液滴在HS-P/MCH修飾的金電極表面，于37℃反應1 h后，用電解質緩沖溶液I-Buffer清洗電極，并在I-Buffer溶液中進行SWV電化學測量。

3 結果與討論

3.1 CHA反應歷程

如圖1（STEP Ⅲ）所示，CHA反應基本組分為兩個序列部分互補的發(fā)卡型DNA（簡稱H1和H2）。由于互補序列均被發(fā)卡結構封閉，因此二者反應動力學嚴重受阻，無法自發(fā)雜交形成雙鏈結構。在加入引發(fā)劑C1（僅3-2-1部分）后，C1的區(qū)域1片段會作為立足點，識別H1的粘性末端1*，隨即開啟鏈遷移反應，打開H1，形成C1-H1雜交體。C1-H1中暴露出的區(qū)域3會作為立足點識別H2的粘性末端區(qū)域3*，進而引發(fā)第二次鏈遷移反應，形成C1-H1-H2中間產(chǎn)物。在該中間產(chǎn)物中，C1與H1只有8個堿基互補，因此無法穩(wěn)定雜交[23，30]，會自發(fā)從H1上脫落，生成反應終產(chǎn)物H1-H2雜交體。而脫落的C1則會再次識別未反應的H1，參與下一輪H1-H2自組裝反應。為表征反應進程，H1-H2雜交體中暴露的區(qū)域2會與區(qū)域5-6一起再次開啟另一次基于立足點的鏈遷移反應，將標記有淬滅集團的探針Q從標有熒光集團的F上置換掉，最終產(chǎn)生可以檢測到的熒光增強信號。由反應歷程可見，C1能否與H1作用的關鍵在于區(qū)域1是否處于非封閉的自由狀態(tài)。

3.2 LAMP-發(fā)卡型中轉探針-CHA的檢測原理

通過發(fā)卡型中轉探針將LAMP產(chǎn)物傳導至上述CHA檢測的原理如圖1，可分解為3個步驟： 在55～60℃的恒溫條件下對待測基因進行LAMP擴增（圖1，STEP I）； LAMP擴增產(chǎn)物與發(fā)卡型中轉探針作用，打開發(fā)卡型中轉探針的莖部，釋放出原本被發(fā)卡型探針封閉的CHA催化劑C1（圖1，STEP Ⅱ）； C1開啟CHA反應（圖1，STEP Ⅲ）。

整個原理的核心部分是發(fā)卡型中轉探針對LAMP產(chǎn)物和下游CHA的中轉效率。由上述CHA工作原理可知，C1能否與H1作用的關鍵在于區(qū)域1是否處于非封閉的自由狀態(tài)。因此，發(fā)卡型中轉探針設計的核心思想即是將C1的區(qū)域1包埋（封閉）在發(fā)卡型探針的莖部，使其無法再行使立足點的功能。而如果將發(fā)卡型中轉探針的環(huán)部設計成LAMP某一環(huán)狀產(chǎn)物的互補序列，則可利用環(huán)狀產(chǎn)物與探針環(huán)部的雜交作用強制性打開中轉探針的莖部，從而游離出C1的區(qū)域1，進而開始CHA反應。

3.3 發(fā)卡型探針的設計和優(yōu)化

鑒于上述檢測原理和設計思想，中轉探針的中轉效率主要取決于兩個因素：封閉效率和打開效率。前者是發(fā)卡探針是否能有效封閉C1的區(qū)域1，決定檢測背景噪音；后者則是LAMP是否能高效打開中轉探針，決定檢測信號強度。為方便優(yōu)化，本研究首先以一條線性單鏈DNA模擬LAMP單鏈環(huán)狀產(chǎn)物，并將其命名為Target，序列從5'端到3'端劃分為3個區(qū)域（a、L*、b）。相應地，發(fā)卡型中轉探針從5'端到3'端劃分為9個區(qū)域（3、o、n、1、m、L、m*、1*、n*），命名為Transducer。其中區(qū)域o和n合并為區(qū)域2；區(qū)域3，2和1合并構成C1序列。區(qū)域L與Target的L*互補，是待測物識別位點。m是隨機加入的緩沖序列。在進行檢測時，預期歷程如圖2所示：Target的L*部分與Transducer的L部分雜交，強制性打開Transducer的莖部，游離出C1的區(qū)域1。然而，反應還可能存在如圖2所示的其它多種副反應和非預期的情況，降低封閉效率或打開效率。

3.4 LAMP產(chǎn)物的檢測

經(jīng)上述優(yōu)化，利用Transducer 3對大腸桿菌基因組中麥芽糖/麥芽糊精轉運ATP結合蛋白MALK合成基因（簡稱malB）的LAMP產(chǎn)物進行中轉和CHA檢測（LAMP引物和靈敏度參見文獻[31]）。如圖 6所示，當LAMP模板濃度低至20拷貝時，仍可被CHA有效檢出，信噪比良好。但即使在大量LAMP產(chǎn)物存在下，CHA的檢測曲線也無法如圖5C（如5 nmol/L Target）所示在短時間內達到反應終點（平臺）。原因是在LAMP產(chǎn)物中，L*序列被限制在環(huán)狀結構中，與Transducer為環(huán)對環(huán)雜交，這種情況下雜交效率會降低很多。

除熒光法之外，本研究還利用電化學方法對上述LAMP產(chǎn)物的傳導檢測體系進行了驗證。方法原理如圖7A所示，將H1的區(qū)域6去掉，并在其3'端修飾上亞甲基藍（MB）探針，稱作H1-MB。將巰基修飾的區(qū)域5*-2*序列（簡稱HS-P探針）通過金-硫鍵固定于金電極表面，并用巰基己醇（MCH）進行封閉，形成HS-P/MCH修飾電極。當CHA反應未發(fā)生前，H1-MB的3'端只有區(qū)域5游離，其只有8個堿基，并不能與HS-P的5*穩(wěn)定雜交。而當LAMP產(chǎn)物經(jīng)過Transducer 3中轉，并引發(fā)H1-MB和H2的CHA組裝后，H1釋放出游離的區(qū)域2，區(qū)域2和區(qū)域5組成的區(qū)域2～5長達16個堿基，可與HS-P的區(qū)域5*-2*雜交成穩(wěn)定的雙鏈結構，進而將MB探針帶至電極表面，引發(fā)可以檢測到的MB氧化還原電流。如圖7B所示，采用電化學方法，同樣達到了如熒光方法相近的信噪比，證明此中轉方法的普適性。

4 結 論

本研究提供了一套設計發(fā)卡型中轉探針的詳細規(guī)律和思路，使其能作為恒溫擴增反應和下游CHA核酸分子線路間的有效橋梁，將基因序列信息準確、特異地傳導至熒光和電化學信號。在這樣一個恒溫擴增-中轉探針-CHA檢測構成的檢測流程中，恒溫擴增是靈敏度的主要來源，中轉探針和CHA是特異性的主要來源，也是信號幅度的主要來源。而中轉探針的引入，也使得基于CHA的基因檢測更為方便，并更具普適性。針對不同的基因序列，僅僅通過簡單地設計一套中轉探針，即可將基因序列傳導至一套性能良好的CHA反應，無需重新設計整個CHA反應。中轉探針的設計方法并非僅限于發(fā)卡型一種，本課題組也報道過三通、四通結構的中轉方法[31～33]。這些不同的中轉方法各具優(yōu)勢，可以全面滿足各種類型的檢測需求，充分顯現(xiàn)出核酸分子線路在實際應用中的巨大潛力和廣闊前景。

References

1 Liu D Y， Daubendiek S L， Zillman M A， Ryan K， Kool E T. J. Am. Chem. Soc.， 1996， 118（7）： 1587-1594

2 Guatelli J C， Whitfield K M， Kwoh D Y， Barringer K J， Richman D D， Gingeras T R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87（5）： 1874-1878

3 Compton J.Nature， 1991， 350（6313）： 91-92

4 Walker G T， Fraiser M S， Schram J L， Little M C， Nadeau J G， Malinowski D P. Nucleic Acids Res.， 1992， 20（7）： 1691-1696

5 Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， Yonekawa T， Watanabe K， Amino N， Hase T. Nucleic Acids Res.， 2000， 28（12）： e63

6 Vincent M， Xu Y， Kong H M. EMBO Rep.， 2004， 5（8）： 795-800

7 Piepenburg O， Williams C H， Stemple D L， Armes N A. PLOS Biol.， 2006， 4（7）： e204

8 Craw P， Balachandran W. Lab Chip， 2012， 12（14）： 2469-2486

9 Gill P， Ghaemi A. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids， 2008， 27（3）： 224-243

10 Zhang X Z， Lowe S B， Gooding J J. Biosens. Bioelectron.， 2014， 61： 491-499

11 Li J， Macdonald J. Biosens. Bioelectron.， 2015， 64： 196-211

12 Li B L， Chen X， Ellington A D. Anal. Chem.， 2012， 84（19）： 8371-8377

13 Zhao Y X， Chen F， Li Q， Wang L H， Fan C H. Chem. Rev.， 2015， 115（22）： 12491-12545

14 Stojanovic M N， Stefanovic D， Rudchenko S. Acc. Chem. Res.， 2014， 47（6）： 1845-1852

15 Wang F A， Lu C H， Willner I. Chem. Rev.， 2014， 114（5）： 2881-2941

16 Jung C， Ellington A D. Acc. Chem. Res.， 2014， 47（6）： 1825-1835

17 Bi S， Yue S Z， Zhang S S. Chem. Soc. Rev.， 2017， 46（14）： 4281-4298

18 Qu X M， Zhu D， Yao G B， Su S， Chao J， Liu H J， Zuo X L， Wang L H， Shi J Y， Wang L H， Huang W， Pei H， Fan C H. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， 56（7）： 1855-1858

19 Dirks R M， Pierce N A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2004， 101（43）： 15275-15278

20 Choi H M T， Chang J Y， Trinh L A， Padilla J E， Fraser S E， Pierce N A. Nat. Biotechnol.， 2010， 28（11）： 1208-1212

21 Zhang D Y， Turberfield A J， Yurke B， Winfree E. Science， 2007， 318（5853）： 1121-1125

22 Yin P， Choi H M T， Calvert C R， Pierce N A. Nature， 2008， 451（7176）： 318-322

23 Li B L， Ellington A D， Chen X. Nucleic Acids Res.， 2011， 39（16）： e110

24 Wu Z K， Fan H H， Satyavolu N S R， Wang W J， Lake R， Jiang J H， Lu Y. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， 56（30）： 8721-8725

25 Li F， Zhang H Q， Wang Z X， Li X K， Li X F， Le X C. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（7）： 2443-2446

26 Wu C C， Cansiz S， Zhang L Q， Teng I T， Qiu L P， Li J， Liu Y ， Zhou C S， Hu R， Zhang T， Cui C， Cui L， Tan W H. J. Am. Chem. Soc.， 2015， 137（15）： 4900-4903

27 Ma C P， Wang W S， Li Z X， Cao J J， Wang Q Y. Anal. Biochem.， 2012， 429（2）： 99-102

28 Jiang Y， Li B L， Milligan J N， Bhadra S， Ellington A D. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（20）： 7430-7433

29 Yang Z L， Liu Y C ， Lu W， Yuan Q P， Wang W， Pu Q S， Yao B. Talanta， 2016， 152： 301-307

30 Qu X M， Wang S P， Ge Z L， Wang J B， Yao G B， Li J， Zuo X L， Shi J Y， Song S P， Wang L H， Li L， Pei H， Fan C H. J. Am. Chem. Soc.， 2017， 139（30）： 10176-10179

31 Tang Y D， Lu B Y， Zhu Z T， Li B L. Chem. Sci.， 2018， 9（3）： 760-769

32 Li B L， Jiang Y， Chen X， Ellington A D. J. Am. Chem. Soc.， 2012， 134（34）： 13918-13921

33 Tang Y D， Zhu Z T， Lu B Y， Li B L. Chem. Commun.， 2016， 52（88）： 13043-13046

Abstract Isothermal nucleic acid amplifications， as powerful as polymerase chain reaction but functioning at a constant temperature， are considered to be very promising technique in achieving point-of-care gene diagnostics. However， until now， their practical applications are still seriously lagged by the bad reliability resulting from the problems such as false positive amplification and low signal amplitude. In this work， a universal transduction method in which any sequence （including loop-mediated isothermal amplification products） could be transduced via a hairpin transducer into a catalyst of a well-engineered circuit （catalytic hairpin assembly， CHA） was established. Because CHA circuit could amplify tens to hundreds fold with especially high sequence specificity， it could provide both accuracy and high amplitude for sequence detection. And for a new targeting sequence， the only sequence needed to be changed was the hairpin transducer. Due to the importance of the transducer， we provided and verified a universal designing rule-set to guarantee the transducing efficiency （signal to background ratio） of the transducer. Transducers designed following this rule set were then proved to be very efficient in detecting pathogen gene targets. As less as near single molecule （20 copies） of pathogen genes could be detected with significant fluorescent and electrochemical signals.

Keywords Isothermal amplification； Universal transduction； Hairpin transducer； Nucleic acid circuit； Catalytic hairpin assembly； Fluorescence； Electrochemistry.

（Received 24 January 2018； accepted 10 April 2018）