孫珊珊 劉元敏 李光宇 吳志勇

摘 要 不同堿基的DNA分子空間占位和帶電狀態(tài)存在差異，其通過單個納米孔時可引起特征性的電流脈沖變化，有望成為新一代單分子測序方法。然而，常規(guī)條件下DNA分子穿過納米孔的速度很快（102 s），引起的電流變化?。╬A級），因此分子亞結構信息的準確獲取對現(xiàn)有儀器設備的性能提出了極高要求。本研究在α-溶血素納米孔的兩端分別引入高粘度和離子導電性較好的離子液體支持電解質，以構建粘度梯度體系，并對溶液的酸度進行優(yōu)化，以期對ssDNA穿孔行為進行調控。初步的研究結果表明，在trans端為純離子液體BmimPF6，cis端為1 mol/L BmimCl、10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 5.5）的條件下，poly（dC）15、poly（dC）20、poly（dC）30和poly（dC）50均出現(xiàn)高抑制比的長阻斷電流脈沖信號，長阻斷事件的阻斷深度達95%以上，持續(xù)時間達102～101 s；同時，基線噪音峰峰值也降低約30%。對可能的機理進行了探討。本研究結果表明，采用離子液體粘度梯度支持電解質體系可以有效調控ssDNA的遷移行為。

關鍵詞 單個納米孔； α-溶血素； 單鏈DNA； 離子液體

1 引 言

由于不同堿基的空間占位和帶電狀態(tài)不同，在電場力驅動下，DNA分子通過單個納米孔時產生電流脈沖變化，依據(jù)其阻斷深度和阻斷時間特征有望獲得分子的帶電情況以及構象等信息，因而可能成為基于單分子的第三代測序技術[1]?；趩蝹€納米孔電流脈沖的傳感和檢測方法具有成本低、速度快和數(shù)據(jù)分析相對簡單等優(yōu)勢。在常規(guī)的支持電解質條件下，DNA分子穿孔速度快（4～10 μs/base），這對單個堿基的精準檢測提出了挑戰(zhàn)[2]。

常用的調控穿孔速度的方法有增加納米孔內壁與DNA分子間的相互作用，如納米孔內壁修飾正電荷增強其與DNA分子間的靜電作用[3，4]、在納米孔內壁共價連接環(huán)糊精減小納米孔孔徑以增加DNA分子穿孔時的摩擦力[5，6]或是采用光鑷[7]、磁鑷[8]、分子馬達[9]等方法增加DNA分子遷移時的機械阻力。另一類方法則是通過改變緩沖介質條件，如降低溫度[10]、調節(jié)溶液酸度[11]、使用谷氨酸鹽[12]等高粘度的支持電解質，以增加DNA分子遷移時的流體阻力，降低DNA分子的遷移速度。離子液體（IL）是一類在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的低溫熔融鹽。其咪唑鹽離子Bmim+與DNA分子之間存在靜電和疏水性締合作用[13～16]，從而形成穩(wěn)定的復合物。α-溶血素納米孔的限制孔徑僅略大于ssDNA分子直徑[17]，而Bmim+與DNA分子形成的復合物體積變大，因而有望產生更加明顯的阻斷信號。2009年，de Zoysa等[18]以突變體（M113F）7 α-溶血素（α-HL）蛋白通道為傳感器，在120 mV偏置電壓和1 mol/L氯化1-丁基-3-甲基咪唑（BmimCl）均勻電解質條件下觀測到ssDNA產生長短兩種阻斷信號，長阻斷信號的停留時間比常用的KCl電解質增加了近兩個數(shù)量級。2015年，F(xiàn)eng等[19]以1-甲基-3-丁基六氟磷酸鹽（BmimPF6）和KCl為支持電解質，在二硫化鉬單個固態(tài)納米孔兩端構建了粘度梯度體系，基于Bmim+與DNA分子之間及DNA分子與孔內壁之間的相互作用，實現(xiàn)了不同堿基的單核苷酸的識別。

4 結 論

基于集成電流脈沖檢測系統(tǒng)（eONE）和α-HL蛋白孔研究了含有離子液的支持電解質、粘度梯度以及酸度對ssDNA遷移行為的影響。咪唑類離子液體中Bmim+與DNA分子中磷酸基團上的氧負離子發(fā)生鍵合作用，使得ssDNA的有效體積變大，其在納米通道內的阻斷深度和遷移時間明顯增加。同時，在α-HL納米孔的trans端引入高粘度的BmimPF6離子液體，建立粘度梯度，增大了DNA分子穿孔時的能壘。初步研究結果表明，在優(yōu)化的粘度梯度體系和優(yōu)化酸度條件下，體系表現(xiàn)出對不同鏈長DNA的停留時間和不同堿基捕獲率的區(qū)分能力。對于長鏈DNA（poly（dC）50），其阻斷時間相比于常規(guī)介質條件增加了3個數(shù)量級。采用離子液體粘度梯度支持電解質體系可以有效地調控ssDNA的遷移行為。

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Abstract Due to the difference in spatial configuration and charge of the bases in a DNA molecule， characteristic translocation current pulses through a single nanopore could be obtained. This could become the basis of DNA sequencing method. However， due to the fast translocation speed （sub-micro seconds） and the small current change （about pA）， it is still a challenge to obtain the accurate molecular substructure with present electronic techniques. In this work， in order to control the translocation behavior of ssDNA， two kinds of ionic liquids with high viscosity and conductivity were introduced to establish a viscosity gradient with the α-hemolysin single nanopore interface and the acidity of the solution was optimized. The trans chamber contained pure BmimPF6 and the cis chamber contained 1 mol/L BmimCl and 10 mmol/L Tris-HCl （pH 5.5）. Preliminary experiment results under this electrolyte configuration showed that poly（dC）15， poly（dC）15， poly（dC）30 and poly（dC）50 exhibited obvious long duration pulses with high current suppression ratio. The blocking depth reached more than 95% of long blocking events. The duration time of long blocking events prolonged to tens or hundreds of milliseconds. Meanwhile， the peak-peak of baseline noise was reduced by about 30%.

Keywords Single nanopore； α-Hemolysin； Single-stranded DNA； Ionic liquid

（Received 17 November 2017； accepted 25 April 2018）