孫樂樂 蘇瑩瑩 高延靜 李威 呂慧 李賓 李迪

摘 要 生物大分子參與生命活動的各個過程，在單分子水平上實時觀測和分析生物大分子自身的結構動態(tài)以及生物大分子相互作用的動態(tài)過程，對于深入理解生物大分子的作用機制具有重要意義。自提出以來，單分子熒光共振能量轉移技術逐漸展現出其在研究生物大分子構象變化和相互作用過程等方面的巨大潛力，一系列新的作用機理陸續(xù)被提出。本文對單分子熒光共振能量轉移技術在蛋白質與核酸分子構象動態(tài)變化、蛋白質-蛋白質相互作用以及蛋白質-核酸相互作用等方面取得的研究進展進行了綜述。

關鍵詞 單分子熒光共振能量轉移； 生物大分子； 構象動態(tài)； 相互作用； 評述

1 引 言

細胞生命活動各個過程都離不開蛋白質、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用機制對于理解基本生物學過程至關重要，然而普通的生物學研究手段無法實時觀測生物大分子發(fā)揮作用時的狀態(tài)變化，只能間接地觀測宏觀現象，然后對過程機制進行推斷。依據宏觀現象推出的作用機理只能在一定程度上幫助人們認識生物過程，生物分子究竟如何發(fā)揮作用，必須有微觀的證據才更有說服力，例如ATP合成酶的作用機制、G蛋白偶聯受體如何傳遞信號等，都是在取得單分子水平上的證據后才得到更加深入的認識[1～3]。對于宏觀系綜研究， 單分子研究的最大優(yōu)勢是可以直接觀測到單個生物分子發(fā)揮作用時的構象動態(tài)或生物分子間相互作用時分子間距離的變化[4～8]，獲取的機制更加接近真實情況。此外，單分子水平的研究能夠揭示生物分子之間的個體差異[9]，有助于全面深入地認識生物分子的功能性質。

目前，在單分子水平研究生物分子構象變化或生物分子相互作用動態(tài)過程的技術有光鑷[10]、 磁鑷[11，12]、原子力顯微鏡[13～16]及單分子熒光技術[17～21]。光鑷和磁鑷技術要求高，操作難度大，無法進行高通量研究；原子力顯微鏡的成像時間分辨率低，因此在單分子研究方面應用不多。單分子熒光技術起源于20世紀90年代[17]，目前已經逐漸成熟地被用于生物學領域，并出現多個分支，其中單分子熒光共振能量轉移技術（SM-FRET）被廣泛用于生物分子相互作用的研究[22]。單分子熒光共振能量轉移技術是指能夠觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉移的技術[23]，具有以下優(yōu)勢：（1）熒光共振能量轉移的原理使其能夠觀測到生物大分子發(fā)揮功能時不同結構域或亞基之間空間位置的變化，或者分子之間相對距離的變化[23]，這些變化對于直接理解生物分子的作用機制十分重要； （2）目前全內反射熒光顯微鏡廣泛應用于SM-FRET研究，其利用激光全反射產生的隱逝波進行照明，具有極高的信噪比，能夠觀測到界面上單個熒光分子；同時利用高速的制冷型電荷耦合器件（CCD）進行成像，時間分辨率可以達到亞毫秒水平。該高時間分辨率對于實時觀測快速的相互作用或構象變化過程至關重要[24]； （3）光學成像允許同時對多個目標進行觀測，高通量觀測便于比對被研究對象個體之間的差異； （4）成熟的基因工程技術和化學修飾方法使得研究者能夠對蛋白質或核酸分子進行定點熒光標記[25～28]，同時，豐富的界面封閉和目標物固定方法可以保證觀測的特異性[23]。自1996年，基于SM-FRET技術的研究取得了一系列成果[29]。本文將圍繞單分子熒光共振能量轉移技術在蛋白分子自身構象動態(tài)變化[30～38]、蛋白質-蛋白質動態(tài)相互作用[6，7，39]、核酸分子自身構象動態(tài)變化[40～47]以及蛋白質-核酸動態(tài)相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果進行綜述。

2 單分子熒光共振能量轉移技術

熒光共振能量轉移現象是供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊，且兩個分子間距離小于10 nm時，供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光，同時供體自身的熒光強度減弱的現象，在生物學研究中常被用于鑒定兩種蛋白質之間是否發(fā)生相互作用。SM-FRET技術是觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉移。目前，SM-FRET實驗中最常用的成像儀器是全內反射熒光顯微鏡（TIRFM），包括棱鏡型和物鏡型兩類（圖1A）[63]。商業(yè)化的TIRFM多為物鏡型，這是因為物鏡型TIRFM激發(fā)光和熒光都經過物鏡，樣品臺有更大的操作空間，能夠更好的與其它設備聯用，如顯微操作設備。除了設備，SM-FRET實驗最關鍵的是研究對象的定點熒光標記以及對象在界面上的特異性固定。核酸定點標記比較容易，蛋白定點標記則要依賴基因工程手段，還要保證標記的位點不影響蛋白結構。將研究對象特異性地固定在石英片或蓋玻片表面，對于觀測實驗十分重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封閉玻璃表面，然后通過抗體或生物素-親和素進行固定（圖1B）[63]。SM-FRET實驗中獲得的數據是熒光供體和受體分子熒光強度隨時間的變化的軌跡，然后通過表觀FRET效率方程計算出對應的FRET效率隨時間變化的軌跡（圖1C）[63]，進而對FRET效率進行統(tǒng)計分析，以獲得變化規(guī)律。

3 單分子熒光共振能量轉移技術用于生物大分子構象和相互作用動態(tài)研究

3.1 單分子熒光共振能量轉移技術研究蛋白分子構象動態(tài)

蛋白質分子的折疊和構象動態(tài)變化直接關系到其自身功能，研究蛋白質折疊過程和構象動態(tài)變化，有助于理解蛋白分子形成功能結構及發(fā)揮功能的機理。1999年，Ha等[30]首次將SM-FRET應用于單個葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease，SNase）分子的結構動態(tài)研究。他們將熒光供體（Tetramethylrhodamine，TMR）和熒光受體（Cy5）修飾到SNase的兩個特定位點上，通過觀測分析單個SNase上TMR和Cy5的熒光共振能量轉移效率，發(fā)現SNase分子之間存在不同的構象波動模式，這歸因于蛋白骨架結構或側鏈在毫秒級時間范圍內的波動。同時，他們通過觀測分子間的熒光共振能量轉移獲得了SNase與單個底物DNA分子之間的動態(tài)相互作用信息。該研究為后續(xù)研究單個蛋白分子結構動態(tài)以及蛋白折疊提供了新思路。

利用示綜研究手段研究非均相反應動力學中的波動，以及相關的酶結構的變化行為，復雜反應中非同步的性質等十分困難[9]。Chen等[31]研究了T4溶菌酶在催化大腸桿菌的細胞壁水解反應時的結構變化信息。他們在酶的兩個互不干擾位點特異性地修飾熒光供體-受體分子對，通過分析供體和受體分子熒光強度隨時間的變化信息可以得到酶的鉸鏈彎曲行為，發(fā)現每個酶分子的催化反應的速率常數之間存在較大的差異性。

包含未折疊或弱折疊域的天然無序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）在細胞信號轉導過程中發(fā)揮重要作用，IκBα是IDPs的典型代表[64]。研究表明， IκBα可通過其不穩(wěn)定的錨蛋白重復區(qū)（Ankyrin repeat 5-6，AR5-6）結合并調控轉錄因子NFκB的功能[65]，但是難以獲得關于AR5-6結構動態(tài)信息。Lamboy等[32]通過SM-FRET研究發(fā)現，自然態(tài)的IκBα的結構并不是固定不變的（圖2A），長時間的觀測結果表明IκBα可以在緊密的折疊態(tài)和松弛的不穩(wěn)定態(tài)之間發(fā)生轉換，但后者是主要狀態(tài)（圖2B）。另外，在結合NFκB后，IκBα的結構波動受到抑制（圖2C）。IDPs的不穩(wěn)定區(qū)結構波動較大，適合用SM-FRET進行觀測，因此SM-FRET還被用于研究其它與疾病相關的IDPs，如α-Synuclein[66] 和 p53[67]，這些研究取得了傳統(tǒng)手段無法獲取的單分子動態(tài)信息，加深了對IDPs的理解。

3.2 單分子熒光共振能量轉移技術研究蛋白質-蛋白質動態(tài)相互作用

蛋白質-蛋白質相互作用普遍存在于生命活動的各個過程，包括細胞信號轉導、細胞骨架結構形成等[70，71]。細胞膜表面受體響應配體信號發(fā)生聚集的過程對于有些受體活化是必須的，了解基于蛋白質-蛋白質相互作用的受體-配體復合物形成過程對于研究信號如何傳遞十分重要。Sako等[7]將SM-FRET和單分子追蹤（Single-molecular tracking，SMT）技術結合，實時檢測熒光修飾的表皮生長因子（EGF）與其受體（EGF-EGFR）的結合過程和EGF-EGFR復合物的聚合過程（圖3A）。他們通過對獲取的單分子軌跡進行統(tǒng)計分析，發(fā)現一個EGF分子首先和一個EGFR二聚體結合成復合物，然后直接結合第二個EGF分子。他們推測EGFR二聚體在結合第二個EGF之前已經形成了二聚體，進而通過SM-FRET實驗直接證明了EGF-EGFR二聚體的形成（圖3B）。

原核和真核生物經常利用能在細胞的質膜形成孔道的毒蛋白（Pore-forming toxins，PFTs）來殺死其它細胞，在細菌毒性方面發(fā)揮重要作用[72]。PFTs的形成一般是多個水溶性的前體蛋白單體結合到細胞膜上，然后前體蛋白發(fā)生構象變化進而相互結合組裝成孔道[73]。了解孔道形成的過程機制有助于理論研究和相關藥物研發(fā)，但是由于孔道形成過程中涉及多種動力學中間體，傳統(tǒng)方法難以對整個過程進行研究。Nguyen等[6]首次利用SM-FRET研究了紅細胞膜表面γ溶血素的協同自組裝過程。金黃色葡萄球菌殺白細胞素快速組分（LukF）和γ溶血素第二組分（HS）是組成細胞膜表面γ溶血素的兩個部分，他們在前體蛋白LukF和HS的特異位點上分別修飾TMR（熒光供體）和IC5（熒光受體），通過觀測和分析紅細胞膜上兩種前體蛋白的FRET信號及受體單獨的熒光信號，統(tǒng)計出每個低聚物的亞基的數量。他們推測在單體和細胞膜結合、低聚物成孔以及最后形成孔團簇的的自組裝途徑中，存在多種低聚物中間體。通過檢測序列中間態(tài)的結合平衡常數發(fā)現，整個過程大概包含有11個序列平衡常數，存在3種協同聚合狀態(tài)，分別是二聚和二聚體的相互聚合、單孔的自組裝以及孔的聚合。這種將單分子熒光共振能量轉移的方法應用在單分子層面上對蛋白聚合中間體的觀察和分析，為研究細胞膜表面蛋白的動態(tài)相互作用過程開辟了新的途徑。2015年，Benke等[74]將SM-FRET和微流控技術、雙聚焦熒光相關光譜和停-流圓二色等結合，詳細研究了另一種孔道形成毒蛋白（Bacterial cytolytic toxin ClyA）的組裝機制（圖3C）。他們在每一個單體上修飾熒光供體（A488）和受體（A594），通過FRET效率及其它表征，提出了孔道形成的過程模型并推導出相關的動力學參數（圖3C）。該研究也說明，將SM-FRET和其它新技術結合起來可以深入研究許多生物學問題。最近，有研究者提出用多色SM-FRET研究多種蛋白之間的動態(tài)相互作用過程[39]。

3.3 單分子熒光共振能量轉移技術研究核酸分子構象動態(tài)變化過程

核酸最基本的功能是作為生物體的遺傳信息載體，部分核酸分子還具有催化功能和調控功能[75]，直接觀測核酸分子的構象動態(tài)有助于理解核酸發(fā)揮功能的機制?；衾线B接體（Holliday junction）是基因重組過程中的重要中間體[76]，盡管傳統(tǒng)的動力學研究方法可以預測到霍利迪連接體能在兩種堆積異構體之間進行轉換，但是由于無法測得同步轉變過程，動力學數據以及結構的動態(tài)信息無法獲得。McKinney等[41]在霍利迪連接體的兩端修飾熒光供體Cy3和受體Cy5（圖4A），首次直接觀測到單個霍利迪連接體在兩種構象之間進行轉變，發(fā)現霍利迪連接體構象轉變的速率和DNA的序列﹑抗衡離子的種類﹑溫度等相關。同時他們獲得的動力學信息提示霍利迪連接體的堆積構象轉變和其分支的遷移存在聯系。該研究首次展示了SM-FRET在研究DNA結構動態(tài)方面的巨大潛力。Joo等[77]利用SM-FRET技術發(fā)現了霍利迪連接體中少見的結構種類以及離子對連接體的影響。 隨后，2005年，McKinney等[78]又觀察到了霍利迪連接體一步步自發(fā)地分支遷移的過程。很多生物過程包括基因重組都存在張力，為了能夠研究霍利迪連接體這個對力敏感的結構在外力作用下的納米級微小變化，Hohng等將SM-FRET和光鑷技術相結合來觀測霍利迪連接體受到不同方向的拉伸力時的構象變化[40]。如圖4B所示，霍利迪連接體的一端連在界面上，另一端通過一個長雙鏈DNA和磁珠連接，通過改變霍利迪連接體與長雙鏈DNA連接的位置可以在3個不同方向上施加< pN 的力（圖4C）。通過分析力的作用下霍利迪連接體上熒光對的FRET效率，分析霍利迪連接體構象轉變的中間態(tài)，這與之前只能觀測到構象轉變的終態(tài)相比是一個重大突破。

核酶（Ribozyme）是一類具有催化功能的核酸（DNA或RNA），其中RNA核酶相比于DNA核酶，種類和功能更加豐富，包括化學鍵的連接﹑結構的折疊﹑以及催化等功能[75，79]。這些功能發(fā)揮的過程中表現出多種動力學途徑和過渡態(tài)，利用單分子熒光技術研究這些復雜的過程能更直觀地得到每個RNA分子的結構分布狀態(tài)以及實時的結構變化信息，進而更準確地對其動力學特征等進行分析[79]。1999年，Ha等[42]首次利用SM-FRET研究核糖體中RNA分子的結構變化。他們利用FRET效率的變化研究發(fā)現核糖體蛋白S15和Mg2+作用對三螺旋交聯的RNA分子構象分布影響很大，尤其是Mg2+處于中間濃度時構象表現出反常分布，這些構象變化與核糖體功能直接相關。Nahas等[80]研究了發(fā)卡RNA核酶的催化過程，發(fā)現發(fā)卡RNA核糖酶的裂解動力學和鍵合動力學完全不同。另外，SM-FRET技術也使他們能夠在同一個分子上觀察到裂解和結合的多次循環(huán)，從而檢測到RNA分子在不同狀態(tài)之間轉換的速率。2007年，Hee等研究了金屬依賴的單個DNA核酶的折疊和催化性質[43]，發(fā)現Zn2+和Mg2+可以引導DNA核酶折疊成更緊湊的結構，以進行催化裂解反應。但是，當Pb2+作為輔助因子時，DNA核酶則不需要提前折疊。

RNA是如何折疊成為天然結構狀態(tài)的的過程對于研究RNA的功能特征十分重要，但是對RNA折疊過程的研究卻大大落后于蛋白折疊的研究，這主要是因為RNA的勢能圖比較復雜，對RNA折疊過渡態(tài)進行表征更加困難[81]。Bokinsky等[81]利用SM-FRET實驗，實時檢測發(fā)卡核酶在不同結構狀態(tài)之間的平衡轉換。如圖4D所示，研究模型是WTAC5發(fā)卡結構的RNA核酶，他們用FRET熒光基團對發(fā)卡結構的兩端進行標記，并在其中一端的不同鏈上修飾生物素，通過這種方法使其可以固定在界面上，以便更好地進行單分子觀測。研究發(fā)現，金屬陽離子的加入，可以使RNA核酶的發(fā)卡結構發(fā)生改變，熒光對之間的FRET效率也會發(fā)生改變。另外，隨著周圍溫度的改變，RNA核酶在兩種狀態(tài)之間轉換的速率也會發(fā)生改變，他們還總結出了兩種狀態(tài)之間的自由能圖譜（圖4E）。Wilson等[82]同樣利用單分子熒光共振能量轉移技術研究了離子介導的RNA核酶折疊，在核酶結構環(huán)的附近加入中間體后，其折疊速率提高500倍。Brenner等[83]研究了鳥嘌呤在核糖開關結構中的作用，為RNA調控基因表達提供了一個模型。最近，Uhm等[44]還利用SM-FRET研究了大腸桿菌硫胺素焦磷酸鹽核糖開關的共轉錄折疊動態(tài)，Manz等[45]研究了S-腺苷甲硫氨酸核糖開關的能級。

3.4 單分子熒光共振能量轉移技術研究蛋白質-核酸動態(tài)相互作用

DNA復制＼＼遺傳信息轉錄和翻譯等重要生物過程都存在蛋白與核酸的動態(tài)相互作用。解旋酶在DNA復制過程中發(fā)揮重要作用，它可以利用ATP水解產生的能量解開DNA雙螺旋，很多疾病與之相關[84]。 2002年，Ha等[48]利用SM-FRET技術首次實時觀測了大腸桿菌解旋酶打開DNA雙鏈的啟動和重啟過程。他們在有單鏈伸出的雙鏈一端修飾熒光供體和受體（圖5A），通過FRET效率監(jiān)測解旋過程（圖5B）。結果表明，解旋酶的單體可以利用水解ATP產生的能量朝向單雙鏈連接處運動，但是解旋需要形成完整的解旋酶；而且解旋過程會暫時中斷和重新啟動，這可能是由于解旋酶暫時脫離DNA然后又重新結合到DNA上開始工作。 Myong等[50]通過SM-FRET觀測發(fā)現，大腸桿菌解旋酶可以在DNA上面重復穿梭，能夠清楚地看到每一個單體可以利用ATP水解產生的能量在單鏈DNA上面發(fā)生移動。解旋酶在DNA上遷移的過程中會驅動DNA結合蛋白從DNA上解離，但是其中的機制難以說明；另外，解旋酶遷移時的步幅也未得到證明。2010年，Park等[85]以PcrA解旋酶為對象進行SM-FRET觀測實驗，發(fā)現PcrA解旋酶會優(yōu)先在滯后鏈上移位，并使滯后鏈發(fā)生卷曲，形成高度重復的環(huán)形單鏈，這種結構的形成使他們推測出PcrA解旋酶移位的步幅是一個核苷酸，同時使DNA發(fā)生卷曲要求PcrA解旋酶具有更開放的構象，這種構象可以快速除去結合在DNA上的RecA蛋白。

DNA復制過程中雙螺旋被打開后容易發(fā)生損傷， 修復損傷的過程中RecA蛋白扮演重要角色[86]。之前的研究[87]表明，RecA可與單鏈DNA結合形成螺旋形核酸-蛋白纖維，這種纖維促進了基于同源重組的損傷修復，但是RecA與DNA結合的動態(tài)過程難以觀測。2006年，Joo等建立了一種基于SM-FRET的方法，能夠實時觀測單個RecA蛋白與DNA結合和解離的過程（圖5C）[49]。利用基于隱馬爾科夫模型的分析方法，他們首次獲得了RecA纖維生長的動力學信息（圖5D）。RecA蛋白催化同源重組的一個重要步驟是尋找同源雙鏈DNA， Ragunathan等利用基于SM-FRET的高時空分辨率成像方法對此過程進行了觀測[88]。他們的實驗結果支持了RecA蛋白纖維進行同源檢索的滑動模型，即RecA蛋白纖維會沿著雙鏈DNA進行擴散運動，這種滑動模式可以使檢索同源雙鏈DNA的速度提高200倍。

核糖體在細胞中負責將mRNA攜帶的信息翻譯成蛋白，是由蛋白質和RNA構成的復合體[89]。實時觀測核糖體蛋白和RNA的組裝過程有助于理解核糖體功能結構的形成。細菌的30S核糖體由21種蛋白在一條16S rRNA（核糖體RNA）通過層級組裝構成[89]，其中核糖體蛋白S16 對于30S核糖體的后續(xù)組裝步驟十分關鍵，一個重要問題是前期蛋白的組裝對后續(xù)蛋白組裝的影響[51]。 2017年，Abeysirigunawardena等[51]利用三色SM-FRET研究了結合在16S的5'區(qū)域的核糖體蛋白S4﹑S17和S20促進下一個蛋白（S16）進入復合物的過程。如圖5E所示，他們在16S rRNA的螺旋3（Helix 3）上標記Cy7，S4蛋白上標記Cy5，S16、S17和S20蛋白上標記Cy3，通過Cy5-Cy7和Cy3-Cy5的FRET信號監(jiān)測復合物的形成過程（圖5F）。他們發(fā)現S4和S20蛋白，而不是S4和S17蛋白，結合到16S rRNA后可以促進S16蛋白的加入。S17和S20都能穩(wěn)定16S 5'區(qū)域的螺旋連接結構，但是只有S20可以使16S rRNA的構象能夠穩(wěn)定S16蛋白的加入。S16結合到16S rRNA上后，16S rRNA的結構趨于松散，促進了30S核糖體后續(xù)組裝過程。

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)被廣泛用于生命科學研究。 2016年，Singh等[57]首次用SE-FRET實時觀測了RNA指導的核酸內切酶識別靶標DNA的過程。最近，有研究者利用SM-FRET 研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)中I-E型檢測復合物如何快速找到靶標以及Cas9切割DNA時的構象動態(tài)[52，53，56]。

4 總結與展望

單分子熒光共振能量轉移技術已被成功用于研究許多重要的生物學過程，并取得了一些突破性的進展， 但也有其自身的局限，如基于熒光分子間距離變化的共振能量轉移信號只能提供被標記位點之間的距離變化信息，但是無法測量兩個位點沿著怎樣的軌跡產生距離變化，這種信息對于理解生物過程也很重要。未來可能需要發(fā)展單分子多色熒光共振能量轉移，同時結合晶體學數據和理論模擬進行數據分析，以解決上述問題。單分子熒光共振能量轉移技術的另一個局限是無法測得生物過程的力學信息，這可能需要更多地與單分子操縱技術（如光鑷、磁鑷等）結合進行研究。單分子熒光共振能量轉移技術是學科交叉產生的技術，其自身的逐漸完善，以及更多地與其它技術聯合，必然可解決更多生物難題。

References

1 Noji H， Yasuda R， Yoshida M， Kinosita K. Nature， 1997， 386（6622）： 299-302

2 Gu L， Li C， Aach J， Hill D E， Vidal M， Church G M. Nature， 2014， 515（7528）： 554-557

3 Jakobs D， Sorkalla T， Haeberlein H. Curr. Med. Chem.， 2012， 19（28）： 4722-4730

4 Ha T. Curr. Opin. Struct. Biol.， 2001， 11（3）： 287-292

5 Ha T J. Biochemistry， 2004， 43（14）： 4055-4063

6 Nguyen V T， Kamio Y， Higuchi H. Embo J.， 2003， 22（19）： 4968-4979

7 Sako Y， Minoguchi S， Yanagida T. Nat. Cell Biol.， 2000， 2（3）： 168-172

8 Sasmal D K， Pulido L E， Kasal S， Huang J. Nanoscale， 2016， 8（48）： 19928-19944

9 Lu H P， Xun L Y， Xie X S. Science， 1998， 282（5395）： 1877-1882

10 Block S M， Goldstein L S B， Schnapp B J. Nature， 1990， 348（6299）： 348-352

11 Gosse C， Croquette V. Biophys. J.， 2002， 82（6）： 3314-3329

12 Lipfert J， Kerssemakers J W J， Jager T， Dekker N H. Nat. Methods， 2010， 7（12）： 977-980

13 Rief M， Oesterhelt F， Heymann B， Gaub H E. Science， 1997， 275（5304）： 1295-1297

14 Neuman K C， Nagy A. Nat. Methods， 2008， 5（6）： 491-505

15 Carpick R W， Salmeron M. Chem. Rev.， 1997， 97（4）： 1163-1194

16 Chen Z， Liu Y， Wang Y， Zhao X， Li J. Anal. Chem.， 2013， 85（9）： 4431-4438

17 Zumbusch A， Fleury L， Brown R， Bernard J， Orrit M. Phys. Rev. Lett.， 1993， 70（23）： 3584-3587

18 Knight A E， Eccleston J F， Molloy J E. Biophys. J.， 1999， 76（1）： A145-A145

19 Park H， Toprak E， Selvin P R. Q. Rev. Biophys.， 2007， 40（1）： 87-111

20 Joo C， Balci H， Ishitsuka Y， Buranachai C， Ha T. Annu. Rev. Biochem.， 2008， 77： 51-76

21 Forzani E S， Lu D， Leright M J， Aguilar A D， Tsow F， Iglesias R A， Zhang Q， Lu J， Li J， Tao N. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（4）： 1390-1391

22 Ha T. Methods， 2001， 25（1）： 78-86

23 Rasnik I， McKinney S A， Ha T. Accounts Chem. Res.， 2005， 38（7）： 542-548

24 Stroehl F， wong H H W， Holt C E， Kaminski C F. Methods Appl. Fluoresc.， 2018， 6（1）： 014004

25 Cornish V W， Benson D R， Altenbach C A， Hideg K， Hubbell W L， Schultz P G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1994， 91（8）： 2910-2914

26 Freidel C， Kaloyanova S， Peneva K. Amino Acids， 2016， 48（6）： 1357-1372

27 Seo T S， Bai X P， Ruparel H， Li Z M， Turro N J， Ju J Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2004， 101（15）： 5488-5493

28 Yang A， Ha S， Ahn J， Kim R， Kim S， Lee Y， Kim J， Soell D， Lee H Y， Park H S. Science， 2016， 354（6312）： 623-626

29 Lerner E， Cordes T， Ingargiola A， Alhadid Y， Chung S， Michalet X， Weiss S. Science， 2018， 359（6373）： eaan1133

30 Ha T J， Ting A Y， Liang J， Caldwell W B， Deniz A A， Chemla D S， Schultz P G， Weiss S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1999， 96（3）： 893-898

31 Chen Y， Hu D H， Vorpagel E R， Lu H P. J. Phys. Chem. B， 2003， 107（31）： 7947-7956

32 Lamboy J A， Kim H， Lee K S， Ha T， Komives E A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2011， 108（25）： 10178-10183

33 Diez M， Zimmermann B， Borsch M， Konig M， Schweinberger E， Steigmiller S， Reuter R， Felekyan S， Kudryavtsev V， Seidel C A M， Graber P. Nat. Struct. Mol. Biol.， 2004， 11（2）： 135-141

34 Terry D S， Kolster R A， Quick M， LeVine M V， Khelashvili G， Zhou Z， Weinstein H， Javitch J A， Blanchard S C. Nat. Commun.， 2018， 9： 230

35 Grossman-Haham I， Rosenblum G， Namani T， Hofmann H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2018， 115（3）： 513-518

36 Dyla M， Terry D S， Kjaergaard M， Sorensen T L M， Andersen J L， Andersen J P， Knudsen C R， Altman R B， Nissen P， Blanchard S C. Nature， 2017， 551（7680）： 346-351

37 Dolino D M， Chatterjee S， MacLean D M， Flatebo C， Bishop L D C， Shaikh S A， Landes C F， Jayaraman V. Nat. Chem. Biol.， 2017， 13（12）： 1232-1238

38 Hu J， Wang Z， Li J. Sensors， 2007， 7（12）： 3299-3311

39 Gotz M， Wortmann P， Schmid S， Hugel T. J. Vis. Exp.， 2018， （131）： e56896

40 Hohng S， Zhou R， Nahas M K， Yu J， Schulten K， Lilley D M J， Ha T. Science， 2007， 318（5848）： 279-283

41 McKinney S A， Declais A C， Lilley D M J， Ha T. Nat. Struct. Biol.， 2003， 10（2）： 93-97

42 Ha T， Zhuang X W， Kim H D， Orr J W， Williamson J R， Chu S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1999， 96（16）： 9077-9082

43 Kim H-K， Rasnik I， Liu J， Ha T， Lu Y. Nat. Chem. Biol.， 2007， 3（12）： 763-768

44 Uhm H， Kang W， Ha K S， Kang C， Hohng S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2018， 115（2）： 331-336

45 Manz C， Kobitski A Y， Samanta A， Keller B G， Jaeschke A， Nienhaus G U. Nat. Chem. Biol.， 2017， 13（11）： 1172-1178

46 Yoo J， Kim H， Aksimentiev A， Ha T. Nat. Commun.， 2016， 7： 11045

47 Wang Y， Tang L， Li Z， Lin Y， Li J. Nat. Protocols， 2014， 9（8）： 1944-1955

48 Ha T， Rasnik I， Cheng W， Babcock H P， Gauss G H， Lohman T M， Chu S. Nature， 2002， 419（6907）： 638-641

49 Joo C， McKinney S A， Nakamura M， Rasnik I， Myong S， Ha T. Cell， 2006， 126（3）： 515-527

50 Myong S， Rasnik I， Joo C， Lohman T M， Ha T. Nature， 2005， 437（7063）： 1321-1325

51 Abeysirigunawardena S C， Kim H， Lai J， Ragunathan K， Rappe M C， Luthey-Schulten Z， Ha T， Woodson S A. Nat. Commun.， 2017， 8： 492

52 Yang M， Peng S， Sun R， Lin J， Wang N， Chen C. Cell Rep.， 2018， 22（2）： 372-382

53 Zeng Y， Cui Y， Zhang Y， Zhang Y， Liang M， Chen H， Lan J， Song G， Lou J. Nucleic Acids Res.， 2018， 46（1）： 350-361

54 Schwarz M， Schall K， Kallis E， Eustermann S， Guariento M， Moldt M， Hopfner K-P， Michaelis J. FEBS Lett.， 2018， 592（3）： 318-331

55 Kilic S， Felekyan S， Doroshenko O， Boichenko I， Dimura M， Vardanyan H， Bryan L C， Arya G， Seidel C A M， Fierz B. Nat. Commun.， 2018， 9： 235

56 Xue C， Zhu Y， Zhang X， Shin Y K， Sashital D G. Cell Rep.， 2017， 21（13）： 3717-3727

57 Singh D， Sternberg S H， Fei J， Doudna J A， Ha T. Nat. Commun.， 2016， 7：12778

58 Ngo TT M， Yoo J， Dai Q， Zhang Q， He C， Aksimentiev A， Ha T. Nat. Commun.， 2016， 7： 10813

59 Ngo TT M， Zhang Q， Zhou R， Yodh J G， Ha T. Cell， 2015， 160（6）： 1135-1144

60 Comstock M J， Whitley K D， Jia H， Sokoloski J， Lohman T M， Ha T， Chemla Y R. Science， 2015， 348（6232）： 352-354

61 Zhang Q， Qiao Y， Hao F， Zhang L， Wu S， Li Y， Li J， Song X M. Chem. Eur. J.， 2010， 16（27）： 8133-8139

62 Wang Y， Li Z， Weber T J， Hu D， Lin C T， Li J， Lin Y. Anal. Chem.， 2013， 85（14）： 6775-6782

63 Roy R， Hohng S， Ha T. Nat. Methods， 2008， 5（6）： 507-516

64 Tompa P. Trends Biochem.Sci.， 2002， 27（10）： 527-533

65 Pahl H L. Oncogene， 1999， 18（49）： 6853-6866

66 Ferreon A C M， Gambin Y， Lemke E A， Deniz A A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2009， 106（14）： 5645-5650

67 Huang F， Rajagopalan S， Settanni G， Marsh R J， Armoogum D A， Nicolaou N， Bain A J， Lerner E， Haas E， Ying L， Fersht A R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2009， 106（49）： 20758-20763

68 Boyer P D. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg.， 1998， 1365（1-2）： 3-9

69 Cornish P V， Ermolenko D N， Noller H F， Ha T. Mol. Cell， 2008， 30（5）： 578-588

70 Akira S， Uematsu S， Takeuchi O. Cell， 2006， 124（4）： 783-801

71 Hall A. Science， 1998， 279（5350）： 509-514

72 Los F C O， Randis T M， Aroian R V， Ratner A J. Microbiol. Mol. Biol. Rev.， 2013， 77（2）： 173-207

73 Parker M W， Feil S C. Prog. Biophys. Mol. Biol.， 2005， 88（1）： 91-142

74 Benke S， Roderer D， Wunderlich B， Nettels D， Glockshuber R， Schuler B. Nat. Commun.， 2015， 6： 6198

75 Sigel R K O， Pyle A M. Chem. Rev.， 2007， 107（1）： 97-113

76 Schwacha A， Kleckner N. Cell， 1995， 83（5）： 783-791

77 Joo C， McKinney S A， Lilley D M J， Ha T. J. Mol. Biol.， 2004， 341（3）： 739-751

78 McKinney S A， Freeman A D J， Lilley D M J， Ha T J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2005， 102（16）： 5715-5720

79 Zhuang X W， Kim H， Pereira M J B， Babcock H P， Walter N G， Chu S. Science， 2002， 296（5572）： 1473-1476

80 Nahas M K， Wilson T J， Hohng S C， Jarvie K， Lilley D M J， Ha T. Nat. Struct. Mol. Biol.， 2004， 11（11）： 1107-1113

81 Bokinsky G， Rueda D， Misra V K， Rhodes M M， Gordus A， Babcock H P， Walter N G， Zhuang X W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2003， 100（16）： 9302-9307

82 Wilson T J， Nahas M， Araki L， Harusawa S， Ha T， Lilley D M J. Blood Cells Mol. Dis.， 2007， 38（1）： 8-14

83 Brenner M D， Scanlan M S， Nahas M K， Ha T， Silverman S K. Biochemistry， 2010， 49（8）： 1596-1605

84 Lohman T M， Tomko E J， Wu C G. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2008， 9（5）： 391-401

85 Park J， Myong S， Niedziela-Majka A， Lee K S， Yu J， Lohman T M， Ha T. Cell， 2010， 142（4）： 544-555

86 Kowalczykowski S C. Trends Biochem. Sci.， 2000， 25（4）： 156-165

87 Story R M， Weber I T， Steitz T A. Nature， 1992， 355（6358）： 318-325

88 Ragunathan K， Liu C， Ha T. Elife， 2012， 1： e00067

89 Ramakrishnan V. Cell， 2002， 108（4）： 557-572

Abstract Biomacromolecules participate in various kinds of vital processes. Observing and analyzing their structural dynamic and the dynamic processes of intermolecular interaction at molecular level is important for understanding the action mechanism. Since its advent， single molecular fluorescence resonance energy transfer （SM-FRET） has demonstrated its great potential in studying the conformational change and interaction process of biomacromolecules， and a series of new mechanisms have been revealed. This review summarized recent progresses of SM-FRET in studying protein structural dynamic， nucleic acid structural dynamic， protein-protein and protein-nucleic acid interactions.

Keywords Single molecular fluorescence resonance energy transfer； Biomacromolecule； Structural dynamic； Interaction； Review

（Received 1 March 2018； accepted 3 April 2018）