謝弘歷

（江蘇省無(wú)錫市錫山區(qū)安鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇 無(wú)錫 214191）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由 A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)病毒性疾病，被國(guó)際獸疫局確定為一類(lèi)傳染病。自1878年首次在意大利發(fā)生和流行后，140年來(lái)在世界各地多次流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

某種病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱(chēng)為血凝，也稱(chēng)直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱(chēng)血凝試驗(yàn)。

當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲?，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱(chēng)為紅細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱(chēng)血凝抑制試驗(yàn)。

1 材料與儀器

1.1 病毒與血清

本文所用病毒尿囊液、血清皆由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 相關(guān)試劑的配置

表1 PBS液配制

1.2.1 PBS液的配制（pH:7.2）

1.2.2 1%紅細(xì)胞懸液的配置

（1）采新鮮的雞血，其中加抗凝劑1/5～1/10左右；

（2）分裝入10mL的離心管中（未滿(mǎn)則用PBS液補(bǔ)足量），配平后用離心機(jī)離心10 min，14000rpm/min；

（3）離心結(jié)束后，棄去上清液，加PBS吹打，配平后再次離心；

（4）反復(fù)離心3次，吹打3次即可；

（5）根據(jù)紅細(xì)胞體積，用PBS配成溶液濃度為1%的紅細(xì)胞懸液。

1.3 儀器

恒溫金屬水浴鍋CHB-100型（杭州大和熱磁電子有限公司）、各種量程微量移液器、微量振蕩器、96孔V型微量反應(yīng)板。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 HA試驗(yàn)

具體步驟：按照表2，向1～12孔加25μL PBS；吸取25μL病毒，并從第1孔開(kāi)始稀釋一直稀釋到第11孔，11孔稀釋完后棄去25μL，第12孔不加病毒；12孔全部再加一遍PBS，劑量為25μL，注意懸空滴加；12孔全部再加一遍1%紅細(xì)胞懸液，劑量為25μL，注意滴加時(shí)要懸空滴加；輕微震蕩混勻；放37℃恒溫箱20min，觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 HI試驗(yàn)

具體步驟：按照表3，向1～12孔加25μL PBS；吸取25μL陽(yáng)性血清，并從第1孔開(kāi)始稀釋一直稀釋到第10孔，10孔稀釋完后棄去25μL，第11、12孔都不加血清；4單位病毒的配制：即將一個(gè)血凝單位的病毒增加至4倍濃度，例如一個(gè)血凝單位為1:64，4個(gè)血凝單位則為64/4=16倍稀釋?zhuān)?倍的病毒+15倍的PBS）；從第1孔開(kāi)始，病毒懸空滴加至第11孔，每孔加病毒25μL，第12孔用25μLPBS代替；振蕩混勻，室溫或37℃溫箱15～30min；每孔加25μL1%紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫10min后開(kāi)始觀察，直到結(jié)果出現(xiàn)。

3 血凝及血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

由表4得出病毒尿囊液的HA效價(jià)為27，將HA試驗(yàn)中得到效價(jià)為27的尿囊液，用PBS按1:4稀釋成4U病毒，然后進(jìn)行HI試驗(yàn)。

由表5可以得出，該病毒樣品既不能被H9亞型禽流感抗血清抑制，也不能被NDV陽(yáng)性血清抑制，只能被H5亞型禽流感抗血清抑制，其HI效價(jià)為28?？沙醪脚袛酁镠5亞型禽流感病毒。

4 小結(jié)與討論

病毒樣品HA血凝素效價(jià)可達(dá)27，HI效價(jià)達(dá)28，且血凝活性不能被抗新城疫病毒血清和AIV～H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制抑制，排除雞新城疫和H9，初步判斷為H5亞型禽流感。HA和HI試驗(yàn)不僅可以用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鑒定，更可用于禽群免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)。該試驗(yàn)是目前世界衛(wèi)生組織和國(guó)際動(dòng)物健康組織進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的方法，而且因其具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡(jiǎn)便、能夠處理大量樣品，并能在短時(shí)間內(nèi)報(bào)告抗體水平等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室疫情監(jiān)測(cè)和免疫抗體檢測(cè)中最常用的方法。因此靈活掌握HA和HI試驗(yàn)，對(duì)畜禽疫情監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展具有重要意義。

表2HA試驗(yàn)

表3 HI試驗(yàn)

表4 血凝試驗(yàn)結(jié)果

表5 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果