賈一新 孟 旭 焦玉清 韓 薇 李 巖 羅文琦 王宏娟

心臟移植(heart transplantation,HTx)是治療終末期心臟病的有效方法。排斥反應(yīng)(acute rejection,AR)是影響HTx近遠(yuǎn)期療效的重要因素[1-2]。早期診斷和治療AR是心臟移植患者長(zhǎng)期存活的重要保障。利用心電生理發(fā)現(xiàn)和診斷排斥反應(yīng)已經(jīng)有較多的研究：排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，心室電壓減低[3-4],心肌阻抗增加[5]，靜息電位降低[6]，心肌內(nèi)心電圖(intramyocardial electrograms, IMEG)QRS波幅降低，心室刺激反應(yīng)的T波降支最大斜率(the maximum slope of the descending T wave of the ventricular evoked response，VER T slope)降低[7]等。這些研究揭示了排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞電生理信息的改變，但其中的機(jī)制并不清楚。動(dòng)作電位(action potential，AP)的形態(tài)和時(shí)長(zhǎng)反應(yīng)了心肌細(xì)胞受到刺激后的電生理特性，而瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)是AP復(fù)極I期的主要成分，Ito電流密度及動(dòng)力學(xué)特征的改變可以顯著地改變心肌的電生理特征,間接影響其后其它電流的激活和失活過(guò)程,對(duì)動(dòng)作電位的時(shí)程和形態(tài)有較大影響[8-9]。目前已有研究證實(shí)，在許多心血管疾病中表現(xiàn)出Ito電流和通道表達(dá)的改變，然而，在心臟移植排斥反應(yīng)中AP與Ito電流密度的變化并不清楚，以及其與上述排斥反應(yīng)心電生理特征是否相關(guān)也未有研究，因此，本研究以大鼠異位心臟移植模型為樣本，擬研究心臟移植物排斥反應(yīng)時(shí)心肌細(xì)胞AP與Ito電流密度的變化。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性,8周齡,Brown Norway(BN)大鼠,共60只，體質(zhì)量230g左右；雄性8周齡,Lewis大鼠,20只，體質(zhì)量230g左右。40只,BN大鼠作為供體，20只BN大鼠和20只Lewis大鼠作為受體。所有動(dòng)物由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院動(dòng)物室提供并喂養(yǎng)，遵循動(dòng)物福利原則，并得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.異位心臟移植 采用改良大鼠腹部心臟移植動(dòng)物模型手術(shù)方法[10-11]。心臟移植物冷缺血時(shí)間<45m。每日經(jīng)腹部觸摸檢查移植心臟存活情況，如有移植物丟失，再進(jìn)行補(bǔ)充，確保研究組例數(shù)。

3.實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各20只，均分為四組，每組5只。四組動(dòng)物分別在移植后第2、4天處死，迅速獲取心臟移植物，一組行病理檢查，一組行電生理檢查。

4.病理檢查 于術(shù)后第2、4天，處死各亞組大鼠，獲取移植心臟。以蘇木素-伊紅(HE)染色，參考ISHLT排斥反應(yīng)分級(jí)方法[12]，在光鏡下以半定量評(píng)分的方式評(píng)估移植心臟心肌細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)情況[13-14]。ISHLT grade 0記為0分； ISHLT grade 1A記為1分； ISHLT grade 1B記為2分；ISHLT grade 2記為3分； ISHLT grade 3A記為4分； ISHLT grade 3B記為5分； ISHLT grade 4記為6分。

5.電生理檢查 (1)移植物心室肌細(xì)胞制備 取出供心，離體心臟放入盛有4℃ Buffer B的10cm小皿中，清洗心臟，迅速去除脂肪和心包膜，游離主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心房。打開(kāi)恒流泵，主動(dòng)脈逆行插管連于Langendorff灌流裝置(圖1)上，心臟內(nèi)血液清除干凈后改為Buffer A灌流，繼而酶液灌流。心室肌組織剪成盡量小的組織塊，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞從心肌碎塊上分離，獲得單個(gè)心室肌細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)鈣完成，膜片鉗實(shí)驗(yàn)中選擇桿狀，外形完整，透光度好，橫紋清晰無(wú)顆粒的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(圖2)。

(2)全細(xì)胞膜片鉗記錄 實(shí)驗(yàn)在室溫(20～25℃)下進(jìn)行，細(xì)胞孵育0.5h后將小皿中的上清液緩慢倒出，分別加入相應(yīng)的細(xì)胞外液，同時(shí)要配合使用對(duì)應(yīng)的電極內(nèi)液。小皿固定于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，固定浴液電極。盡量減低噪音的干擾。顯微鏡下選取外形完整，形狀規(guī)則，邊緣整齊，表面光滑無(wú)顆粒，橫紋清晰，無(wú)收縮的長(zhǎng)桿狀細(xì)胞。設(shè)定到電流鉗模式給與一定時(shí)間和強(qiáng)度的電流描記各細(xì)胞組全細(xì)胞動(dòng)作電位的變化。設(shè)定到電壓鉗模式給與一定時(shí)間和強(qiáng)度的電壓刺激描記各細(xì)胞組鉀、鈉、鈣等通道電流的變化。膜片鉗放大器系統(tǒng)通過(guò)A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)進(jìn)行連接，PatchMaster軟件控制相關(guān)的刺激信號(hào)以及電流、電壓信號(hào)的采集(圖3)。玻璃微電極拉制儀拉制玻璃毛胚成尖端直徑1～1.5μm的玻璃微電極。打開(kāi)監(jiān)測(cè)窗口，出現(xiàn)測(cè)試脈沖電流方波信號(hào)(圖4)。充灌好電極內(nèi)液的玻璃微電極正壓入水，電阻為4～5ΜΩ，電極接觸細(xì)胞前補(bǔ)償液接電位。用三維操縱儀調(diào)節(jié)電極尖端的位置使其移向細(xì)胞表面，輕壓細(xì)胞微變形，1mL注射器負(fù)壓吸引封接心肌細(xì)胞，形成高阻封接(Giga seal)，封接電阻1GΩ以上,脈沖信號(hào)消失，完成封接，進(jìn)行電極電容補(bǔ)償。觀察1～2min，如果不能自行破膜，1mL注射器負(fù)壓吸引。漏電流提示失敗，退出玻璃微電極，退出前先解除微電極管內(nèi)負(fù)壓狀態(tài)。若破膜成功，則會(huì)出現(xiàn)充放電現(xiàn)象，形成全細(xì)胞的記錄模式，此時(shí)要對(duì)全細(xì)胞膜電容進(jìn)行補(bǔ)償。補(bǔ)償完成后給與相應(yīng)的電信號(hào)刺激，進(jìn)行信號(hào)采集。信號(hào)經(jīng)四階貝塞爾的低通濾波器，截止頻率為1kHz，采樣頻率為10kHz。

圖1 Langendorff灌流裝置的示意圖；圖2 分離得到的大鼠移植心臟心室肌的細(xì)胞

圖3 全細(xì)胞膜片鉗記錄示意圖；圖4 玻璃微電極負(fù)壓吸引封接心肌細(xì)胞

(3)記錄方法 鉗制模式：將PatchMaster膜片鉗系統(tǒng)Recording Mode調(diào)至Whole Cell模式，封接破膜后給予相應(yīng)的電壓刺激，記錄細(xì)胞的鉀、鈉和鈣離子通道電流；同樣的方法封接破膜后，將Recording Mode調(diào)至C-Clamp模式，I-membrane數(shù)值設(shè)為0，給予相應(yīng)的電流刺激，記錄細(xì)胞的動(dòng)作電位。

1)瞬時(shí)外向鉀電流 記錄Ito時(shí)細(xì)胞外液中加入CdCl20.1mmol/L以阻斷鈣電流，加入CdCl21mmol/L以阻斷鈣激活氯電流。

記錄Ito的I-V曲線(xiàn)時(shí)Vh為-90mV，先給予一個(gè)50ms至-40mV的去極化刺激以滅活I(lǐng)Na。Vt從-40mV開(kāi)始，以10mV階躍刺激至60mV，時(shí)程400ms，采樣頻率10kHz。以測(cè)試電壓60mV的Ito峰值電流密度在用藥后的變化作為觀察指標(biāo)。

記錄Ito穩(wěn)態(tài)失活的刺激方案：維持電壓-90mV，給予300ms從-120mV至60mV階躍10mV的前刺激，然后測(cè)試電壓鉗制在60mV 300ms記錄Ito電流，并比較用藥后變化。

記錄Ito失活后時(shí)間依賴(lài)性恢復(fù)的刺激程序：采用雙脈沖刺激，維持電壓-90mV，繼而先后給予兩個(gè)去極化到60mV持續(xù)200ms的去極化刺激P1、P2，其時(shí)間間隔Δt依次增大分別設(shè)為1，5,10,15,20,25，30,35，40,45,50,55，60,65,70,75,80,85，90(ms)。記錄P2對(duì)應(yīng)的峰電流I。以I/Imax對(duì)Δt做出穩(wěn)態(tài)失活后恢復(fù)曲線(xiàn)。

2)內(nèi)向整流鉀電流 記錄Ik1時(shí)，在細(xì)胞外液中加入CdCl20.1mmol/L以阻斷鈣電流。記錄Ik1的I-V曲線(xiàn)的刺激方案為Vh-80mV，Vt從-150mV開(kāi)始，以10mV階躍刺激至 10mV，鉗制時(shí)間400ms，采樣頻率2kHz。

3)動(dòng)作電位 采用電流鉗方式。形成高阻封接并破膜后，給予5ms，以100pA階躍，自100pA階躍至3nA的電流刺激，頻率為20kHz，其后以2nA，5ms的電刺激觀測(cè)動(dòng)作電位電壓的變化。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)獲得的原始電流數(shù)據(jù)均采用PatchMaster及Igor軟件進(jìn)行分析和測(cè)量，使用GraphPad Prism 5對(duì)測(cè)量后的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和作圖。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用非配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．動(dòng)物模型建立結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物模型建立結(jié)

2．術(shù)后第2天、第4天對(duì)照組移植心臟HE染色檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)心肌細(xì)胞壞死(圖5～8)。術(shù)后第2天，實(shí)驗(yàn)組移植心臟組織學(xué)檢查可見(jiàn)血管周?chē)烷g質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞浸潤(rùn)，排斥反應(yīng)半定量評(píng)分(1.75±0.5)分。術(shù)后第4天，實(shí)驗(yàn)組移植心臟組織學(xué)檢查可見(jiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)灶性及多灶性心肌細(xì)胞壞死，排斥反應(yīng)半定量評(píng)分(4.2±0.45)分(圖9～12)。

圖5～6 對(duì)照組大鼠移植術(shù)后第2天移植心臟HE染色；圖7～8：對(duì)照組大鼠移植術(shù)后第4天移植心臟HE染色

圖9～10 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2天，移植心臟組織學(xué)檢查，可見(jiàn)血管周?chē)烷g質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞浸潤(rùn)；圖11～12：實(shí)驗(yàn)組術(shù) 后第4天，移植心臟組織學(xué)檢查，可見(jiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)灶性及多灶性心肌細(xì)胞壞死

3.瞬時(shí)外向鉀電流 移植術(shù)后第2天，兩組心室肌細(xì)胞的Ito密度在-40～60mV測(cè)試電壓下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第4天，與對(duì)照組比較，在各測(cè)試電壓下實(shí)驗(yàn)組移植心臟心室肌細(xì)胞Ito密度均顯著下降(P<0.05,表2～3，圖13)。

表2 術(shù)后第2天兩組Ito密度

表3 術(shù)后第4天兩組Ito密度

4.內(nèi)向整流鉀電流 移植術(shù)后第2天，兩組心室肌細(xì)胞的Ik1密度在-150～ 50mV測(cè)試電壓下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后第4天，與同基因組比較，在-150～-60mV、60mV測(cè)試電壓下同種異基因組移植心臟心室肌細(xì)胞Ik1密度顯著下降(P<0.05，表4～5，圖14～15)。

圖13 大鼠移植心臟心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流的電流密度-電壓曲線(xiàn)圖 A:移植術(shù)后第2天；B:移植后第4天

圖14 移植后第2天心室肌細(xì)胞IK-1電流電流密度-電壓曲線(xiàn)圖;圖15 移植后第4天心室肌細(xì)胞IK-1電流密度-電壓曲線(xiàn)圖

APD/ms移植后第2天移植后第4天同基因組同種異基因組P值同基因組同種異基因組P值A(chǔ)PD5011.33±1.85721.46±2.5160.013616.00±2.68719.17±1.7770.3272APD9049.28±5.62188.08±6.4450.001659.34±5.183104.0±9.5230.0064

表4 術(shù)后第2天兩組Ik1密度

5.動(dòng)作電位 移植術(shù)后第2天，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植心臟心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長(zhǎng)[APD50分別為(11.33±1.857)vs. (21.46±2.516)，P=0.0136；APD90分別為(49.28±5.621)vs. (88.08±6.445)，P=0.0016]。移植術(shù)后第4天，實(shí)驗(yàn)組心臟心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長(zhǎng)[APD90分別為(59.34±5.183)vs. (104.0±9.523)，P=0.0064](表6)。

表5 術(shù)后第4天兩組Ik1密度

討 論

動(dòng)作電位是細(xì)胞處于興奮狀態(tài)的標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)顯示心肌細(xì)胞動(dòng)作電位在同種異基因大鼠腹部心臟移植術(shù)后顯著延長(zhǎng)，提示心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的延長(zhǎng)可能是心肌細(xì)胞電生理改變的基本電生理機(jī)制。Ito是動(dòng)作電位發(fā)生時(shí)的第一個(gè)復(fù)極電流[15]，在心肌細(xì)胞去極化時(shí)快速激活、失活，形成動(dòng)作電位快速?gòu)?fù)極1期和平臺(tái)2期起始部[16]。Ito具有電壓、時(shí)間及頻率依賴(lài)性，其大小決定了動(dòng)作電位1相的電位幅度，其活性還影響了電壓門(mén)控鈣通道的激活和平臺(tái)期內(nèi)向電流與外向電流的平衡，從而介導(dǎo)了復(fù)極2期的波幅及持續(xù)時(shí)間。在大鼠、犬及人類(lèi)，Ito是控制心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的主要電流。在病理情況下，Ito大小、生理特性發(fā)生改變，導(dǎo)致心室肌Ito跨室壁的電壓梯度發(fā)生變化，導(dǎo)致了心肌復(fù)極化的改變，誘導(dǎo)心肌電重構(gòu)，從而導(dǎo)致心臟電生理學(xué)特性的變化。目前已有研究證實(shí)，在許多心血管疾病中表現(xiàn)出Ito電流和通道表達(dá)的改變。心肌缺血時(shí)，由于缺血缺氧心肌局部代謝產(chǎn)物的堆積，正常的微環(huán)境發(fā)生變化，如 pH 值下降等。研究發(fā)現(xiàn)心室肌細(xì)胞膜上的Ito在缺血、缺氧、pH值改變時(shí)明顯地受到抑制，這可能是心肌梗死后Ito電流密度降低的誘因。體外試驗(yàn)亦證實(shí)缺氧環(huán)境、pH值的微小變化均會(huì)使心肌細(xì)胞的Ito明顯減低，進(jìn)而影響心肌 APD和心肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與同基因大鼠移植心臟心室肌細(xì)胞相比，異基因大鼠心臟移植術(shù)后第4天，Ito密度顯著降低，與實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)一致，因此推測(cè)在心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)時(shí)，心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的延長(zhǎng)與Ito的降低有密切關(guān)系。有研究證實(shí)，Ito通過(guò)影響ICa,L、ICa,NCX來(lái)調(diào)節(jié)心肌的興奮收縮偶聯(lián)[17-19]。因此，Ito在心臟移植排斥反應(yīng)時(shí)的變化最終導(dǎo)致了心臟收縮、舒張功能的受損。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)同種異基因組大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)在術(shù)后第4天顯著降低，Ik1是決定工作心肌細(xì)胞膜靜息電位的主要離子流，在動(dòng)作電位3相快速?gòu)?fù)極化過(guò)程中起著重要作用[20]。這種電流的特點(diǎn)是膜電位負(fù)于靜息電位時(shí)，表現(xiàn)為鉀離子內(nèi)流，當(dāng)細(xì)胞膜輕度去極化時(shí)鉀離子外流，而進(jìn)一步去極化時(shí)，鉀離子外流反而減少甚至消失，具有明顯的內(nèi)向整流性質(zhì)，所以被命名為內(nèi)向整流鉀電流，其典型的I-V曲線(xiàn)成“N”形。Ik1的降低可導(dǎo)致細(xì)胞膜3相復(fù)極化速率減慢，使得動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)。

我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在同種異基因組大鼠心臟移植術(shù)后第2天動(dòng)作電位幅度顯著延長(zhǎng)，而Ito、Ik1變化均不明顯，這說(shuō)明可能還存在其他的因素影響動(dòng)作電位。為明確動(dòng)作電位在心臟移植排斥反應(yīng)時(shí)的變化，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。深入了解心肌細(xì)胞電生理變化機(jī)制，可進(jìn)一步提高心臟移植急性排斥反應(yīng)的診斷和治療。

本實(shí)驗(yàn)的局限在于我們僅研究了排斥反應(yīng)心臟移植物心室肌細(xì)胞的AP、Ito和Ik1，另外還有其他與一些離子通道影響動(dòng)作電位時(shí)程，如Ca2+電流，也會(huì)影響動(dòng)作電位時(shí)程，在心臟排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，Ca2+電流或其他離子電流是否影響動(dòng)作電位的時(shí)程和形態(tài)，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。