崔佩佩，武愛蓮，王勁松，董二偉，南江寬，白文斌，焦曉燕

(1.山西大學 生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農業(yè)科學院 農業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030031； 3.山西省農業(yè)科學院 高粱研究所，山西 晉中 030600)

根際是植物、土壤、微生物及其環(huán)境相互作用的中心，是各種養(yǎng)分和有害物質從無機環(huán)境進入生命系統(tǒng)參與食物鏈物質循環(huán)的必經通道和瓶頸[1]。根際土壤微生物是根際微生態(tài)的重要組成部分，其在根際土壤有機質分解、氮的固定、土壤養(yǎng)分轉化和植株生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，且對環(huán)境變化十分敏感[2]。施肥對根際微生物的影響因肥料的數量、種類、施肥時間長短及不同肥料的配合方式而不同，微生物則通過改變生物量、活性速率和群落結構對不同的施肥產生響應[3]。吳迪等[4]研究認為，施肥會提高根際土壤細菌、真菌和放線菌數量，且有機肥比無機肥效果顯著。蘆思佳等[5]研究發(fā)現，長期平衡施肥使根際土壤微生物量碳、氮的含量增加。文景芝等[6]研究認為，施用有機肥或復合肥均有利于根際微生物的生長繁殖，根際細菌多樣性指數和均勻度指數也有所提高。唐海明等[7]研究認為，長期施用有機肥或無機肥均會促進根際土壤微生物的代謝活性，提高土壤微生物多樣性，且有機肥配施化肥的效果極佳。也有研究表明[8]，施用尿素后土壤微生物功能多樣性顯著降低，但是無機氮肥和磷肥對土壤微生物多樣性無明顯影響。Lovell等[9]研究認為，長期施用無機氮肥會降低土壤微生物活性。雖然目前的研究結果不盡相同，但長期施肥對農田生態(tài)系統(tǒng)的影響極其顯著，進一步研究不同化肥配施對根際微生物生態(tài)的影響對農業(yè)生產和土地可持續(xù)發(fā)展有重要價值。

高粱(SorghumbicolorL. Moench)已經廣泛應用于飼料，且具有較強的耐瘠薄能力，是“鐮刀灣”地區(qū)產業(yè)結構增調的一種作物[10-11]。目前施肥對高粱根際微生物特性的研究僅限于可培養(yǎng)微生物的數量[4]，前人研究發(fā)現，高粱根系分泌的對羥基苯丙酸和對苯醌等生物硝化抑制物能專一抑制土壤中氨氧化微生物，進而抑制硝化作用，提高氮素吸收和氮肥利用率[12-14]，有必要進一步研究高粱根際微生物代謝功能多樣性對氮、磷、鉀脅迫的響應。

本研究以高粱/玉米輪作的長期定位大田試驗為基礎，結合人工溫室的盆栽試驗，采用BIOLOG微平板法研究了長期不同施肥條件下高粱根際土壤微生物功能多樣性的變化，以期明確高粱根際微生物對氮、磷、鉀脅迫的響應，為不同土壤養(yǎng)分條件下高粱的養(yǎng)分管理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試高粱品種為晉中0592。

1.2 試驗設計

大田試驗在山西省晉中市榆次區(qū)山西省農業(yè)科學院東陽試驗基地進行，海拔802 m，年平均氣溫為9.7 ℃，年平均降水量為450 mm，降水70%以上集中在6-9月。試驗地土壤類型為潮土，土壤質地為黏壤土，試驗始于2011年，共設NPK、PK、NK、NP、CK(無肥處理)5個處理，其中每年N、P、K施用量分別為N 225 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 75 kg/hm2，氮、磷及鉀肥分別為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。磷肥和鉀肥作為基肥一次性施入；氮肥的1/2作為基肥，剩余1/2在拔節(jié)期時追施。試驗采用隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)面積為15 m×5 m=75 m2，重復3次。為避免連作障礙對試驗的影響，進行高粱與玉米輪作，從2011年開始種植玉米與高粱的地在2012年分別種植高粱與玉米，以此類推一年一季，年年倒茬，每年的施肥和管理都相同。于2016年5月13日播種， 9月28日收獲，留苗密度為19萬株/hm2，生育期為138 d。

盆栽試驗在山西省農業(yè)科學院人工智能溫室內進行。供試土壤于2017年3月19日采自大田試驗的對應處理。設NPK、PK、NK、NP、CK(無肥處理)5個處理，5個重復。N、P、K施用量分別為：N 0.20 g/kg，P2O50.15 g/kg，K2O 0.15 g/kg。所有肥料用化學試劑配制后，按照處理以每個盆為單元在播前把肥料和風干土混合均勻后裝盆。每個塑料盆裝風干土5 kg。于2017年4月25日播種，為了維持作物生長，在出苗后25 d所有處理補施 P2O50.009 4 g/kg，出苗后31 d定苗為每盆3株，7月3日(穗花期)收獲。各處理供試土壤化學特性如表1所示。與NPK處理相比，PK處理的全氮和硝態(tài)氮含量有所降低，NK處理的有效磷含量和NP處理速效鉀含量顯著降低。

表1 各施肥處理播種前土壤化學特征Tab.1 Soil chemical characteristics before sowing

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。表2-3同。

Note：Different lowercases in a column indicate significant differences at 0.05 level among Different treatments. The same as Tab.2-3.

1.3 根際土樣的采集與處理

在高粱穗花期用抖根法[15]采集根際土樣：田間試驗中隨機選取長勢均勻并有代表性的5株植株，去掉0～2 cm的表土，用小鏟切取高粱根部及其周圍土壤，輕輕抖掉根系外圍土后，用滅菌的鑷子輕刷黏附在根表面的土壤樣品，密封到無菌袋后置于冰盒內運回實驗室，過2 mm 篩混勻后保存于-80 ℃超低溫冰箱。盆栽試驗中按盆取樣，用剪刀剪去地上部植株，去掉0～2 cm的表土后，將盆倒扣到滅菌的報紙上取樣，之后取樣及處理的方法與大田一致。

1.4 土壤微生物代謝功能多樣性測定

采用BIOLOG ECO微平板法測定[16-17]，稱取相當于10 g 烘干土的新鮮土樣，加入到盛有90 mL 無菌水的三角瓶內，用無菌濾膜封口后在200 r/min 下振蕩30 min，然后逐步稀釋到1 000倍。將150 μL 的稀釋液接種到生態(tài)板(ECO MicroPlate， 美國Matrix Technologies Corporation 生產)，每樣1 板(3次重復)，將接種好的測試板加蓋置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，每隔24 h用BIOLOG 自動讀數裝置在波長590 nm 下讀數，連測7 d。

采用Garland等[18]的方法計算測試板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(AWCD)。

AWCD=∑(Ci-R) /31

①

式中，Ci為每個有培養(yǎng)基孔的吸光值；R為對照空白孔的吸光值。

采用Shannon-Wiener多樣性指數(H)，碳源利用豐富度指數(S)(即顏色變化的孔數(吸光值小于0.25 視為顏色沒有變化))，Shannon-Wiener均勻度指數(E)和Simpson優(yōu)勢度指數參數表征土壤微生物群落功能代謝多樣性[19]。

H=-∑PilnPi

②

S=被利用碳源的總數

③

E=H/lnS

④

Ds=1-∑Pi2

⑤

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

⑥

式中，Pi為第i孔吸光值與對照孔吸光值之差與整個平板吸光值總和的比率；H為 Shannon多樣性指數；S為碳源利用豐富度指數。

1.5 數據統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010 對數據進行整理和統(tǒng)計分析；采用SPSS 20.0 進行單因子方差分析和主成分分析，如有顯著差異時用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設定為α=0.05。圖表中數據均為3個重復的平均數±標準誤。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對根際微生物碳源利用能力的影響

平均顏色變化率(AWCD)能夠表征土壤微生物群落的碳源利用率，是反映土壤微生物生理代謝活性、微生物群落功能多樣性的重要指標[20]。AWCD 值增加的越快，表明微生物群落的代謝活性越強[21]。大田試驗結果表明(圖1)，在整個培養(yǎng)期間，NPK和NP處理的AWCD值間均無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)前72 h，NK與NPK和NP處理的AWCD值差異不顯著(P>0.05)，但144 h后與NPK、NP處理比較，NK處理顯著降低了AWCD值(P<0.05)，說明連續(xù)不施鉀肥對微生物碳源利用能力影響不大；而不施磷肥顯著降低了培養(yǎng)后期根際微生物代謝活性。整個培養(yǎng)期間，PK處理的AWCD值顯著高于其他處理(P<0.05)，CK的AWCD值顯著低于其他各施肥處理(P<0.05)；培養(yǎng)結束時，各處理的AWCD值表現為：PK>NPK>NP>NK>CK；與CK處理比較，PK、NPK、NP和NK處理根際微生物對碳源利用能力分別增加了46.26%，24.15%，23.17%和14.04%(P<0.05)；施肥處理顯著影響根際土壤微生物對碳源的利用能力(P<0.05)，PK處理具有最高的AWCD值，說明施肥顯著提高了根際微生物利用碳源的能力，長期不施氮但磷鉀充分時，根際微生物對碳源利用的能力最強，長期不施用氮磷鉀肥顯著降低了根際微生物的代謝活性。

盆栽試驗結果表明，除培養(yǎng)前24 h外，在整個培養(yǎng)期間，NP和NK處理與NPK的AWCD值間均無顯著差異(P>0.05)，但培養(yǎng)后期NP和NK處理均有下降的趨勢，說明盆栽試驗中不施鉀肥或不施磷肥對根際微生物碳源利用能力影響不大。整個培養(yǎng)期間，PK處理的AWCD值最高，但與NPK和NK間差異未達顯著水平(P>0.05)；除培養(yǎng)前24 h外，CK的AWCD值顯著低于其他各施肥處理(P<0.05)；培養(yǎng)結束時，各處理的AWCD值表現為：PK>NPK>NK>NP>CK；與CK處理比較，PK、NPK、NK和NP處理碳源利用能力分別增加了33.76%，23.19%，20.35%和13.39%(P<0.05)。可見，盆栽試驗的結果與大田一致，但處理間差異沒有大田顯著。

圖1 不同施肥處理AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化Fig.1 The change of AWCD value with incubation time in different fertilization treatments

2.2 不同施肥處理對根際微生物利用分類碳源能力的影響

就培養(yǎng)96 h微生物對分類碳源利用情況分析可知(表2)，大田試驗結果，氨基酸類除NK與NP間的差異不顯著外(P>0.05)，未施磷處理(NK和CK)利用氨基酸類物質的能力顯著低于施磷處理(NPK、PK和NP)(P<0.05)。與施氮處理NPK、NP和NK相比，PK對羧酸類物質的利用分別顯著增加了19.14%，34.63%和21.91%；CK則分別顯著降低了35.59%，27.21%和34.09%(P<0.05)。不同處理對胺類物質的利用表現出PK>NP>NPK>CK>NK的趨勢，其中，PK處理顯著高于其他處理，未施磷處理(NK和CK)低于施磷處理(NPK、PK和NP)(P<0.05)。PK和NK對糖類物質的利用無顯著差異，但二者顯著高于其他處理，CK顯著低于其他處理(P<0.05)。不同處理對聚合物的利用表現出PK>NP>NPK>NK>CK的趨勢，其中，施氮處理(NPK、NP和NK)間差異不顯著(P>0.05)，PK顯著高于除NP外的其他處理，CK顯著低于除NK外的其他處理(P<0.05)。不同處理對雙親化合物的利用表現出NPK>NP>PK=CK>NK的趨勢，NPK顯著高于其他處理(P<0.05)。綜上所述，就根際微生物對氨基酸類、羧酸類、胺類、糖類和聚合物的利用而言，PK處理最高，CK最低，且PK處理對羧酸類、胺類的利用顯著高于其他處理，CK對羧酸類和糖類的利用顯著低于其他處理。但缺肥處理對雙親化合物的利用均顯著降低。

盆栽試驗結果表明，不同處理對氨基酸類物質的利用表現出PK>NK>NP>NPK>CK的趨勢，其中，PK顯著高于除NK外的其他處理(P<0.05)，CK顯著低于其他處理(P<0.05)；不同處理對羧酸類和胺類的利用均表現出PK>NK>NPK>NP>CK的趨勢，PK對胺類的利用顯著高于除NK外的其他處理(P<0.05)；對糖類的利用表現出PK>NPK>NK>NP>CK的趨勢，其中，PK顯著高于除NPK外的其他處理(P<0.05)，CK顯著低于其他處理(P<0.05)；PK對聚合物的利用顯著高于其他處理(P<0.05)；不同處理對雙親化合物的利用表現出NPK>NP>PK>NK>CK的趨勢，NPK處理最高，CK最低?？梢?，盆栽試驗較好地驗證了大田試驗的結果，PK處理增加了根際微生物對氨基酸類、羧酸類、胺類、糖類和聚合物的利用，降低了對雙親化合物的利用；CK處理對6類碳源的利用均降低。

表2 不同施肥處理對根際土壤微生物利用分類碳源能力的影響Tab.2 Effects of different fertilization treatments on microbial classification of carbon source capacity in rhizosphere soil

2.3 不同施肥處理對根際微生物群落多樣性指數的影響

利用培養(yǎng)96 h后測定的AWCD值計算微生物群落功能代謝多樣性指數，結果如表3所示。大田試驗不同處理的Shannon-Wiener多樣性指數變化趨勢為：PK>NP>NPK>NK>CK，3個施氮處理NPK、NK和NP間的差異不顯著(P>0.05)，而PK處理顯著高于施氮處理(P<0.05)，CK處理顯著低于施氮處理(P<0.05)。豐富度指數(S)的變化趨勢及處理間的差異均與多樣性指數一致。盆栽試驗中，Shannon-Wiener多樣性指數和豐富度指數變化趨勢為：PK>NPK>NP>NK>CK，除NPK外，PK顯著高于其他處理(P<0.05)。說明長期不施氮肥磷鉀配施可促進根際微生物種類增加，提高土壤微生物多樣性，但不施肥降低了根際土壤微生物的多樣性，微生物種類減少；不施磷肥或鉀肥對微生物種類影響不大；且大田的結果比盆栽顯著。

Shannon-Wiener均勻度指數(E)，大田試驗的變化趨勢為CK>NPK>NK>NP>PK，僅CK處理顯著高于PK處理(P<0.05)；盆栽試驗的變化趨勢為：CK>NP>NK>PK>NPK，CK和NP顯著高于PK和NPK處理(P<0.05)。Simpson優(yōu)勢度指數(Ds)，大田試驗的變化趨勢為PK>NP>NK>NPK=CK，僅 PK處理顯著高于NPK和CK處理(P<0.05)；盆栽試驗的變化趨勢為PK>NP>NPK>NK=CK，PK顯著高于NK和CK處理(P<0.05)。說明長期施用化肥降低了根際微生物群落的均勻度；而磷鉀配施增加了根際土壤微生物的優(yōu)勢度；且在大田中更明顯。

表3 長期不同施肥處理下根際土壤微生物代謝功能多樣性指數Tab.3 Microbial metabolic function diversity index of rhizosphere soil under different long-term fertilization treatments

2.4 不同施肥處理土壤微生物碳源利用的主成分分析

應用主成分分析，根據降維后所得的主成分截荷圖可直觀地反映出不同處理間土壤微生物群落的功能代謝差異[22]。利用培養(yǎng)96 h后測定的數據進行主成分分析，根據提取的主成分個數一般要求累計方差貢獻率達到85% 的原則提取主成分[23]，結果顯示，提取出來的前2個主成分方差貢獻率分別為：大田試驗的貢獻率分別為37.71%和28.09%，盆栽試驗的貢獻率分別為29.48%和20.21%。對前2個主成分進行分析，將不同處理在2個主成分上的得分值以PC1、PC2為橫縱坐標構建主成分截荷圖(圖2)。由圖2可知，大田試驗PC1軸上PK處理分布在正方向，NK和CK處理分布在負方向，NPK和NP處理分布在零點附近；PC2軸上NPK和NP處理分布在正方向，CK、NK和PK處理分布在負方向。對各處理的碳源主成分得分系數進一步進行方差分析，結果表明，在PC1軸上，僅NPK和NP處理間無顯著差異(P>0.05)，其余處理間差異顯著(P<0.05)；在PC2軸上，5個處理間均表現出顯著差異(P<0.05)。

盆栽試驗，PC1軸上PK、NK和NP處理分布在正方向，CK處理分布在負方向，NPK處理分布在零點附近；PC2軸上NPK處理分布在正方向，PK、NK和CK處理分布在負方向，NP處理分布在零點附近；方差分析結果表明，PC1軸上，施氮處理NPK、NK和NP間的差異不顯著(P>0.05)，而PK處理顯著高于施氮處理(P<0.05)，CK處理顯著低于施氮處理(P<0.05)；PC2軸上，5個處理間均表現出顯著差異(P<0.05)。綜上所述，大田試驗中NPK和NP處理根際土壤微生物碳源利用能力和類型差異不顯著，其余處理間差異顯著；盆栽試驗中施氮處理NPK、NK和NP利用碳源能力和類型差異不顯著，其余處理間差異顯著。

圖2 土壤微生物碳源利用的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of soil microbial carbon source utilization

3 結論與討論

土壤中微生物數量龐大，種類繁多，且存在大量無法培養(yǎng)的微生物類群，采用BIOLOG微平板法測定土壤微生物對不同碳源利用能力及其代謝差異，是較為深入了解土壤微生物信息、表征其功能多樣性的一種最具代表性的方法[24]。土壤中微生物的種群數量受土壤和地上部作物的共同影響，長期施肥改變了根際土壤的理化性質[25-26]，根際養(yǎng)分的改變會進一步影響根系分泌物的種類和數量[27]，而根際微生物消耗和轉化根系分泌物中的有機物[28]，進而導致根際微生物群落產生變化。Liljeroth等[29]研究認為，氮對土壤微生物的種群數量和密度的影響是通過改變根系分泌物間接實現的。前人研究發(fā)現，植物有很強的自我調控能力，有些抗逆性較強的植物在環(huán)境養(yǎng)分脅迫時，植物體內會合成專一性的根系分泌物，通過酸化、配位交換及還原作用活化難溶性無機化合物，提高其養(yǎng)分吸收利用效率[28，30]。如白羽扇豆在缺磷脅迫時會分泌大量的檸檬酸[31]，豆科作物在缺鋅脅迫時根系分泌物中糖、氨基酸和有機酸的比例會發(fā)生變化[32]。

黃紅娟等[33]研究認為，假高粱根系分泌物的多樣性在花果期最高，主要分泌對-羥基苯甲醛、對-羥基苯甲酸、對- 羥基苯甲酸乙酯、麥黃酮和香葉木素，其中對-羥基苯甲醛和對-羥基苯甲酸是土壤微生物的碳源，對-羥基苯甲醛能夠改變土壤微生物群落結構及多樣性。

本試驗研究了高粱穗花期根際微生物對氮磷鉀脅迫的響應，結果發(fā)現，缺氮脅迫提高了高粱根際微生物代謝活性，對氨基酸類、羧酸類、胺類、糖類和聚合物的利用能力均得以提高，但降低了對雙親化合物的利用，土壤微生物種類及優(yōu)勢度指數也明顯高于其他處理。前人有關氮脅迫對小麥[17]、蠶豆[22]和玉米[34]微生物群落的研究均未得出類似結論。BIOLOG微平板上的碳源受地上部植物和根系分泌物種類多樣的影響[24]，所以氮脅迫下高粱根際微生物活性增強的原因可能是由于高粱自身為克服和緩解氮素的虧缺而合成并分泌了特定的物質，這些分泌物影響了根際土壤氮轉化過程功能微生物的豐度、多樣性及群落結構，致使原本利用雙親化合物的微生物處于劣勢，而利用羧酸類和胺類等有機物的微生物種類增多，這可能是高粱較其他作物耐氮的原因之一。

高明霞等[17]研究指出，長期施用磷肥可以提高塿土微生物群落的代謝活性，這與本研究結果一致。本研究大田試驗結果表明，長期缺磷顯著降低了培養(yǎng)后期根際微生物代謝活性，這可能是因為高粱是喜磷禾本科作物[35]，缺磷抑制了其根際微生物的生長。而盆栽試驗中，不施磷肥對根際微生物碳源利用能力影響不顯著是受苗期補施磷肥的影響。本試驗中，連續(xù)不施鉀肥對微生物碳源利用能力和多樣性指數的影響不大，一方面可能是因為根據全國第二次土壤普查推薦的土壤養(yǎng)分分級標準來看，本試驗供試土壤的速效鉀含量極高；另一方面可能是由于高粱對鉀不太敏感。但長期不施肥顯著降低了根際微生物對碳源的利用能力，導致微生物種類減少，促進了各種類微生物的均衡發(fā)展，這一結果與前人的研究結果一致[17，24]。其原因可能是由于長期不施肥處理土壤中養(yǎng)分含量低，微生物生長所需的碳源和能源受到了極大的限制。

Garland等[18]研究認為，主成分分析結果中各處理在空間上位置的不同和微生物的碳源利用能力相關聯。本研究大田試驗的主成分分析結果表明，NPK和NP處理根際土壤微生物碳源利用能力和類型差異不顯著，其余處理間差異顯著；而盆栽試驗中施氮處理NPK、NK和NP利用碳源的能力和類型差異不顯著，其余處理間差異顯著。盆栽試驗很好地驗證了大田試驗的結果，而NK處理前后結果的不一致可能是因為盆栽是在控制條件下進行的，養(yǎng)分脅迫沒有大田那樣嚴重，且盆栽補施磷肥導致NK處理缺磷脅迫沒有大田嚴重。

綜上所述，不同施肥處理對高粱根際微生物群落功能多樣性的影響不同。長期磷鉀配施顯著增強了根際微生物的代謝活性，微生物種類及優(yōu)勢度指數均增加；長期氮鉀配施降低了培養(yǎng)后期微生物代謝活性；長期氮磷配施的影響不大；長期不施肥抑制了微生物的生長，但有利于各種類微生物的均衡發(fā)展?？梢姡┓视欣诟纳仆寥牢⑸锾匦?。高粱根際微生物對氮、磷、鉀脅迫的響應不同，氮脅迫時，根際微生物代謝活性的增強可能是高粱耐氮的原因之一。