楊 蕊，韓雪純，李 晴，陳招榮

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384)

梨(Pyrusspp.)是我國分布較廣泛的多年生落葉果樹，在天津市種植面積約4 000 hm2，占全市果樹面積的10%，屬于天津市四大經(jīng)濟(jì)水果之一(棗、葡萄、蘋果和梨)，主要分布在靜海、西青等區(qū)域，與薊州區(qū)的特色果品干果、津西北的桃、漢沽東麗寧河的葡萄構(gòu)成了天津林果的四大產(chǎn)業(yè)區(qū)域[1]。新果園的建立和新品種的引進(jìn)提高了梨果的質(zhì)量和豐富度，但是也為梨樹病害提供了傳播途徑。梨病毒及類病毒在多數(shù)栽培品種中長期潛伏，癥狀不明顯，故病毒病易在梨長期營養(yǎng)繁殖的過程中不斷傳播蔓延[2]，但在感病植株中不僅造成樹勢減弱，影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致果樹絕收，提早枯死，嚴(yán)重威脅著梨的生產(chǎn)[3]。目前，已報道的梨病毒病有20多種，病毒種類包含單鏈RNA病毒、雙鏈RNA病毒、DNA病毒、類病毒等[4-6]。發(fā)生在我國主要栽培梨上面潛伏性病毒和類病毒種類在梨樹上發(fā)生最為普遍，主要有蘋果莖溝病毒 (Applestemgroovingvirus，ASGV)、梨環(huán)紋花葉病毒(Pearringpatternmosaicvirus)即蘋果褪綠葉斑病毒 (Applecholortoticleafspotvirus，ACLSV)、梨脈黃病毒(Pearveinyellowvirus)即蘋果莖痘病毒 (Applestempittingvirus，ASPV)、蘋果銹果類病毒(Applescarskinviroid，ASSVd)和蘋果凹果類病毒(Appledimplefruitviroid，ADFVd)等，主要特點(diǎn)是潛伏侵染無明顯癥狀，常常復(fù)合侵染，具有極大的隱秘性和危險性[4，7-10]。該類潛隱性病毒在田間很難通過肉眼觀察進(jìn)行診斷，而病毒含量較低傳統(tǒng)血清學(xué)的方法很難準(zhǔn)確地對其進(jìn)行檢測。聚合內(nèi)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR法)，反轉(zhuǎn)錄-PCR法以及優(yōu)化的一步多重PCR法，定量PCR法等分子生物學(xué)的方法被廣泛運(yùn)用于潛隱性病毒的檢測中[5]。近幾年隨著新一代深度測序技術(shù)的飛躍發(fā)展，深度測序技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蘋果和梨等核果類果樹病毒病的檢測中[11-12]。

本研究采集天津西青、薊州和大港等地區(qū)采摘的雪花梨、蘋果梨、水晶梨和圓黃梨等品種的新鮮葉片，通過改良梨葉片總RNA提取技術(shù)，建立適用于梨樹病毒病檢測鑒定的單重 RT-PCR 體系，旨在明確天津地區(qū)主要梨栽培品種帶毒情況及病毒種類，為天津地區(qū)苗木檢疫、風(fēng)險性分析以及防治措施的制定提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在天津西青、薊州和大港3個地區(qū)隨機(jī)采摘雪花梨、蘋果梨、水晶梨、圓黃梨、早酥紅梨和金香玉梨等7個品種的新鮮枝葉，總計70株(表1)。

表1 樣品采集信息Tab.1 The information of collected samples

1.2 優(yōu)化梨葉片總RNA提取方法

1.2.1 TRIzol試劑法 使用基于CTAB法的TransZol Up Plus RNA Kit進(jìn)行雪花梨葉片總RNA提取，其具體步驟參照北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransZol Up Plus RNA Kit，ER501-01)的說明書進(jìn)行。

1.2.2 改良CTAB法

1.2.2.1 基礎(chǔ)方法 按照TransZol Plant(北京全式金生物技術(shù)有限公司，ET121-01)試劑盒操作步驟。將新鮮的或液氮凍存的植物樣品稱量后，加入液氮迅速研成粉末狀。每80～100 mg組織加入1 mL TPI溶液。渦旋或用槍頭吹吸數(shù)次，12 000 r/min 4 ℃離心5 min。小心吸取上清，將上清平分至2個新的1.5 mL RNase-free 離心管中。向上清中加入等體積的TPⅡ 溶液(粉紅色)，顛倒混勻數(shù)次，加入1/4上清體積的氯仿，再次顛倒混勻數(shù)次，室溫孵育5 min。12 000 r/min 4 ℃離心5 min。小心吸取上清于新的RNase-free離心管中。向上清中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10 min。12 000 r/min 4 ℃離心10 min。棄上清，此時在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。加入1 mL 75%乙醇(RNase-free 的水配制)，劇烈渦旋。10 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清，室溫晾干沉淀。 加30～40 μL RNA溶解液溶解沉淀，保存樣品于-70 ℃以備長期使用。

1.2.2.2 改良方法1-巰基乙醇 在TPI溶液中分別加入10 μL β-巰基乙醇。

1.2.2.3 改良方法2-巰基乙醇+ DTT 在TPI溶液中分別加入5 μL β-巰基乙醇+5 μL DTT。

1.2.2.4 改良方法3-巰基乙醇+ 抗壞血酸 在TPI溶液中分別加入5 μL β-巰基乙醇+5 μL抗壞血酸。

1.3 RNA質(zhì)量檢測

首先，使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并分析RNA的完整性，上樣量為5 μL，加入1 μL Lording Buffer 在110 V電壓下電泳約15 min，在紫外燈下觀察并照相保存。

其次，取1 μL總RNA溶液稀釋到一定濃度下，利用紫外分光光度計，計算出A260、A280、OD260/280、0D260/230以及RNA的濃度，純RNA OD260/280值應(yīng)為1.8～2.2，OD260/230值應(yīng)為2.0～2.4。RNA 回收率計算：RNA回收率(μg/g)=(OD260×40×原液體積) /提取樣品質(zhì)量(g)，每種方法重復(fù)3次，取平均值。

1.4 引物設(shè)計

檢測引物參考郝璐等[13]發(fā)表的引物序列，由華大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表2所示。

表2 RT-PCR的引物序列以及目標(biāo)片段大小Tab.2 Primers for RT-PCR and the size of the targeted fragments

1.5 反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(RT-PCR)

以O(shè)ligo(dT)為反向引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系如下：Buffer Mix 10 μL；總RNA 8 μL；反向引物Oligo(dT) 1 μL；Enzyme(E-MiX) 1 μL。反應(yīng)條件：將水浴鍋調(diào)整到42 ℃，水浴時間為30 min即可。反轉(zhuǎn)錄完成后會形成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

每一個反應(yīng)體系的總體積都為20 μL，其基本反應(yīng)體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 3 μL；正向引物0.5 μL；反向引物0.5 μL；dNTP 0.5 μL；Buffer 2 μL；TaqEnzyme 0.5 μL；RNase-free Water 13 μL；總體系為20 μL。

PCR以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)為：94 ℃預(yù)處理4 min；94 ℃，30 s，蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)40 ℃，30 s，蘋果莖溝病毒(ASGV)50 ℃，30 s，蘋果莖痘病毒(ASPV)51 ℃，30 s，蘋果凹果類病毒(ADFVd)53 ℃，30 s，蘋果銹果類病毒(ASSVd)60 ℃，30 s，72 ℃，20 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.6 PCR產(chǎn)物的檢測和回收

反應(yīng)結(jié)束后，提取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過EB染色后，使用BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳結(jié)果，并拍照保存，以此來證明檢測的結(jié)果，進(jìn)行回收擴(kuò)增片段。

回收擴(kuò)增片段的程序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。PCR產(chǎn)物的回收參照PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)的說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物純化回收后送至華大基因公司進(jìn)行測序。

采用Blast，DNAMAN 6.0.3.99 軟件對RT-PCR產(chǎn)物所測得的序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同方法獲得的梨葉片總RNA質(zhì)量的比較

采用不同方法提取的雪花梨葉片總RNA電泳結(jié)果見圖1。條帶的完整程度和明暗程度代表RNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示，4種方法均可以提取出一定量的RNA。如圖1所示，改良方法1-巰基乙醇法得到的RNA條帶相對來說最為清晰和完整，所提取RNA 的 28S RNA、18S RRNA 亮度比約為2∶1，完整性較好，表示這種方法提出來的總RNA的質(zhì)量較好，比較適合梨葉片總RNA的提?。换A(chǔ)方法、改良方法2和改良方法3的條帶均不清晰，有降解的情況，并且雜質(zhì)較多。結(jié)合表3總RNA產(chǎn)量的比較結(jié)果可知，基礎(chǔ)方法獲得的總RNA OD260/280的值平均為1.573，RNA獲得率僅為(56.784±11.172)μg/g，說明梨中可能含有的酚類物質(zhì)和大分子糖類物質(zhì)影響梨總RNA的提取質(zhì)量和產(chǎn)量，改良方法2-巰基乙醇+DTT獲得的RNA得率最高，但OD260/280的值平均為1.546，OD260/230的值平均為1.616，均未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)比值，說明提取物中有鹽等小分子物質(zhì)和酚類、蛋白等大分子雜質(zhì)污染。綜合梨葉片的總RNA質(zhì)量與獲得率，改良方法1可以在短時間內(nèi)完成梨葉片總RNA的提取，并且無降解，提取量高，平均濃度可達(dá)73.880 μg/g,符合下一步試驗要求。是提取雪花梨葉片總RNA較為理想的方法。

1．基礎(chǔ)方法；2.改良方法1-巰基乙醇；3.改良方法2-巰基乙醇+DTT；4.改良方法3-巰基乙醇+抗壞血酸。

1.Basic method; 2.Improved method 1-Mercapto alcohol; 3.Improved method 2-Mercapto alcohol + DTT; 4.Improved method 3-Mercapto alcohol+Ascorbic acid.

圖1不同提取方法對雪花梨葉片總RNA完整性的影響
Fig.1TheeffectofdifferentextractionmethodsontheintegrityofthesnowpeartotalRNA

表3 四種方法雪花梨葉片的總RNA質(zhì)量與獲得率Tab.3 The quality and yield of the total RNA of the snow pears obtained by four different methods

2.2 梨病毒檢測結(jié)果

以提取的各樣品梨的總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄后用表2中的病毒和類病毒的特異性引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增獲得了預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測定，將所得的序列與GenBank中已報道的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果證明擴(kuò)增得到的片段為目標(biāo)片段。

2.3 樣品中病毒種類和帶毒率分析

通過RT-PCR鑒定出天津地區(qū)梨樹所攜帶的潛隱性病毒種類有5種，但是帶毒率各有不同。由表4可知，本次研究的70株梨樹總帶毒率平均為48.6%，其中，大港區(qū)7年生的蘋果梨樣品(92.8%)最高，其次是西青區(qū)種植8年生的雪花梨樣品(72.2%)，再次為薊州區(qū)種植9年以上的雪花梨樣品(66.7%)，三者均屬于白梨系統(tǒng)；大港地區(qū)采集的其他梨樣品樹齡均較小，帶毒率由高到低依次為金香玉梨(33.3%)、水晶梨(33.3%)、圓黃梨(13.3%)、早酥紅梨(0)和康佛倫斯(0)，前4種梨品種均屬于砂梨系統(tǒng)，后一種梨屬于西洋梨系統(tǒng)；此外，薊州采集的3年水晶梨樣品(砂梨系統(tǒng))也未檢測到已知的病毒種類。從以上結(jié)果可以看出，種植年份越高的植株，帶毒率越高，不同品種對病毒的敏感性也不相同。

表4 西青區(qū)、薊州區(qū)和大港區(qū)的不同栽培品種中病毒和類病毒種類及帶毒率檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of virus and viroid species and virus carrying rate in different cultivars from Xiqing district，Jizhou district and Dagang district

從病毒種類方面分析，蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)的帶毒率最高，平均為47.1%，其次是蘋果銹果類病毒(ASSVd)，平均為11.4%，蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果凹果類病毒(ADFVd)的平均帶毒率分別為10.0%，8.6%，1.4%。從病毒復(fù)合侵染角度分析，大港地區(qū)采集的7年生樹齡蘋果梨復(fù)合侵染率最高，達(dá)64.3%，而且感染病毒種類最多。

3 討論

RNA的質(zhì)量直接影響其后續(xù)分子生物學(xué)試驗，梨中的多糖、多酚、鹽分子以及其他次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)在RNA提取過程中易與RNA結(jié)合，嚴(yán)重影響RNA的提取效率和質(zhì)量[14-15]。而不同植物種類或同種植物不同組織的RNA提取，往往需要采取不同的提取方法。普通的CTAB法不能有效去除梨葉片中的多糖、多酚類物質(zhì)，RNA提取效率較差，改良方法中加入可以去除多酚和抗氧化的β-巰基乙醇、DTT和抗壞血酸，能有效地提高RNA的得率，但是DTT和抗壞血酸處理對RNA質(zhì)量沒有優(yōu)化作用。因此，本研究確定適合梨葉片RNA提取的方法為改良方法1-巰基乙醇。

梨病毒病為系統(tǒng)性病害，具有分布廣、種類多、寄主范圍廣、隱蔽性強(qiáng)、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，由于我國梨樹種苗生產(chǎn)缺乏病毒病檢測和監(jiān)管，帶毒無性繁殖材料隨意嫁接，苗木市場混亂，新品種推廣缺乏有效監(jiān)控等原因，增加了梨病毒病的傳播和復(fù)合侵染的風(fēng)險[3，10]。通過對天津市3個主要梨栽培產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采樣檢測發(fā)現(xiàn)，本市梨樹潛隱性病毒帶毒率較高，種類較多，所采集的樣品數(shù)量雖然較少，但是種類豐富，而且樹齡多樣，基本可以反映出天津市梨樹種植受病毒病影響的情況。本研究中一些天津地區(qū)局部新引進(jìn)的品種金香玉梨、水晶梨和圓黃梨，雖然種植年份較短，但均檢測出了2種或3種已知病毒，具有復(fù)合侵染現(xiàn)象，而同地塊種植的另外2個品種早酥紅梨和康佛倫斯梨未檢測到已知病毒，說明樣品中的病毒很有可能是引種時由種苗攜帶的。此外，病毒種類和帶毒率隨著樹齡的增加而呈上升趨勢，說明隨著種植年份的增長，在梨樹生長過程中受到病毒病感染的概率增加，梨潛隱性病毒一般可以通過嫁接、修剪工具、根接等方式傳播[9，16]，老舊果園由于樹齡老化、栽培管理不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е虏《静「腥韭屎筒《痉N類日益提高，極大影響了梨樹的產(chǎn)量和品質(zhì)。在所采集的品種中包含了西洋梨系統(tǒng)的康佛倫斯梨，白梨系統(tǒng)的蘋果梨和雪花梨，以及砂梨系統(tǒng)的水晶梨、圓黃梨、金香玉梨和早酥紅梨，不同系統(tǒng)梨帶毒率不同，帶毒率最高的是白梨系統(tǒng)的品種，其次是砂梨系統(tǒng)的部分品種。王國平等[10]也對我國國家梨種植資源圃中5個系統(tǒng)23個主要品種的樹進(jìn)行帶毒率的檢測和比較，不同系統(tǒng)帶毒率有異，帶毒率由高到低依次為西洋梨、白梨和沙梨、新疆梨和秋子梨。說明梨品種及其系統(tǒng)發(fā)育地位與對病毒敏感性有一定相關(guān)性。

鑒于研究結(jié)果顯示同一病毒在不同地區(qū)、不同品種中發(fā)生差異較大，同一地區(qū)、同一品種病毒種類和帶毒率差異也較大，在生產(chǎn)過程中應(yīng)加強(qiáng)果園栽培管理，加強(qiáng)水肥管理，注意林間衛(wèi)生，除去雜草，防治有害昆蟲，林間操作時及時消毒工具，防治人為機(jī)械傳播。種苗方面應(yīng)規(guī)范種苗繁育品種推廣的檢測監(jiān)控，加強(qiáng)檢疫，培育栽培無毒苗，規(guī)范無毒化栽培管理以及推廣高效快速的超低溫冷凍療法在果樹上的應(yīng)用[17-20]，從源頭上控制果樹病毒病和類病毒病的傳播擴(kuò)散，為梨產(chǎn)業(yè)的健康高效發(fā)展打下基礎(chǔ)。