趙曾強(qiáng)，李瀟玲，張 析，張 薇，練文明

(1.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源 利用兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室，新疆 石河子 832000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 阿拉爾 843301)

轉(zhuǎn)錄因子是一類反式作用因子[1]，能夠激活或抑制目的基因在特定的時間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子[2]。植物中較大轉(zhuǎn)錄因子基因家族堿性亮氨酸拉鏈蛋白(The basic leucine zipper，bZIP)在植物生長發(fā)育、衰老和抗逆等生理反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[2-6]。擬南芥與水稻中分別發(fā)現(xiàn)bZIP家族成員127個和94個[7]。根據(jù)bZIP結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Jakoby等[3]將擬南芥的bZIP轉(zhuǎn)錄因子分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10個亞族，而TGA家族基因?qū)儆趬A性亮氨酸拉鏈蛋白家族中的D亞族，它能夠與DNA核心序列(TGACGT)相結(jié)合，激活或抑制下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，在植物抵抗脅迫及花器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[8]， 如D亞族的D3和D5組通過響應(yīng)PR啟動子上的乙烯應(yīng)答元件參與植物抗病反應(yīng)，除此之外，TGA轉(zhuǎn)錄因子還能夠參與水楊酸(Salicylic，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA) 和生長激素等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，來完成抗逆響應(yīng)[9-11]。

研究表明，AtTGA5基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥能提高對霜霉病(Peronosporaparasitica)的抗性[12]；Pontier等[13]將AtTGA2基因?qū)霟煵莺?，轉(zhuǎn)基因煙草對丁香假單胞菌的抗性提高，且病程相關(guān)基因(PR1、PR2和PR3)表達(dá)量升高，表明TGA2轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控病程相關(guān)基因表達(dá)，在植物的抗病防御反應(yīng)中起重要作用；Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AtTGA2、AtTGA5和AtTGA6三者在激活擬南芥系統(tǒng)獲得性抗病中存在功能冗余，當(dāng)敲除三者中任何一個，SA類似物2，6-二氯異煙酸(2，6-dichloroisonicotinic acid，INA)仍能誘導(dǎo)敲除突變體中PR1基因表達(dá)，增強(qiáng)抗病性，反之，將3個基因同時敲除， INA既不能誘導(dǎo)敲除突變體中PR1基因表達(dá)，也不能提高三元突變體的抗病性；田義[15]研究表明，蘋果MdTGA2.1能夠與MdNPR及AtNPR1 相互作用，并且過量表達(dá)該基因可以互補(bǔ)擬南芥TGA2/5/6 三突變體對SA的敏感表型。將TGA2.2基因在煙草中過表達(dá)后，PR1-a和ParA基因表達(dá)量提高，而使TGA2.2基因缺失后，突變體經(jīng)SA處理后，PR1-a和ParA基因不表達(dá)，表明TGA2.2基因在植物中對病原菌的防御起到正調(diào)控作用[16]。西紅柿中，利用VIGS技術(shù)瞬時沉默TGA1a和TGA2.2，用病原菌處理沉默植株后，發(fā)現(xiàn)Pto激酶介導(dǎo)的抗性反應(yīng)減弱，表明TGA1a和TGA2.2可能參與西紅柿對假單胞菌的抗性[17]。

目前，關(guān)于TGA類轉(zhuǎn)錄因子的研究在模式植物中居多，均表明該類基因家族在植物抗病性反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用，本研究在前期通過 Solexa 高通量測序技術(shù)研究枯萎病菌誘導(dǎo)后抗病和感病棉花品種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，結(jié)果表明，枯萎病菌誘導(dǎo)后，在抗、感病品種中，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)活性變化數(shù)量較多，推測 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族可能在棉花抗枯萎病中發(fā)揮重要作用。本試驗在此基礎(chǔ)上，以高抗枯萎病的陸地棉為試驗材料，利用電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)分離與抗枯萎病相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子亞家族TGA轉(zhuǎn)錄因子基因，利用qPCR技術(shù)分析基因表達(dá)特征，為棉花抗枯萎病育種提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 材料種植與處理

試驗所需材料為陸地棉抗枯萎病品種中棉所 12 號[18]。種子消毒后浸泡于無菌水至露白，再將其種植于蛭石中，待真葉長出，移至霍格蘭營養(yǎng)液，定期更換培養(yǎng)液。將接種于查氏固體培養(yǎng)基的枯萎病菌置于查氏液體培養(yǎng)基中，于26 ℃避光振蕩培養(yǎng)7 d，調(diào)至菌液孢子數(shù)為1×107個/mL待用。

1.2 枯萎病菌及激素處理

中棉所 12 號分別在1×107個/mL 的枯萎病菌液、乙烯(1 mmol/L)[19]、水楊酸(50 μmol/L)[19]、茉莉酸(1 mmol/L)[19]溶液中浸泡45 min后，在浸泡后不同的時段0，1，3，6，12，24，48 h取其根部組織，同等條件下將棉苗浸泡于水中，取相同時間段根部組織為Mock，取樣后于低溫保存。

1.3 TGA1與TGA9.2基因克隆

采用 CTAB 法進(jìn)行棉花根部總 RNA提取[20]， 采用全式金公司All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，其操作步驟按說明書進(jìn)行。

利用西域綠洲重點(diǎn)實驗室棉花課題組前期獲得的枯萎病菌誘導(dǎo)棉花后的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從中選取差異表達(dá) bZIP 序列為基因探針，在棉花EST 數(shù)據(jù)庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中，運(yùn)用tBlastN和BlastN獲取同源性較高序列，利用 CAP3 軟件進(jìn)行序列拼接；利用ORF Finder 和SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)軟件進(jìn)行備選基因開放閱讀框ORF分析 和bZIP結(jié)構(gòu)域分析，對符合的目標(biāo)基因進(jìn)行引物設(shè)計(表1)，以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增并通過系列試驗驗證，將獲得的陽性菌株送上海生工進(jìn)行基因測序。

1.4 TGA1與TGA9.2基因序列分析

利用NCBI中ORF Finder進(jìn)行基因ORF分析；利用SMART進(jìn)行蛋白保守域分析；利用Mega 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用GOR4進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析；利用ExPaSy ProtScale進(jìn)行蛋白親/疏水性分析；利用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)的同源建模分析；利用ExPaSy ProtParam進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析。

1.5 實時熒光定量PCR分析

以棉花GhUBQ7(DQ116441)為內(nèi)參基因，qRT-PCR 引物見表1。qPCR 反應(yīng)體系及程序參見 TaKaRa 公司qTaq for Real-Time qPCR說明書。試驗設(shè) 3 個重復(fù)，采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhTGA1與GhTGA9.2基因ORF克隆及分析

利用ORFFinder及 SMART軟件分析，獲得ORF完整且含bZIP結(jié)構(gòu)域及DOG1結(jié)構(gòu)域序列(圖1-A、圖2-A)。以中棉所 12 號的根部cDNA為模板，分別擴(kuò)增出長度為1 281，1 461 bp目的條帶(圖1-B、圖2-B)，測序結(jié)果表明，其核苷酸序列與電子克隆序列一致，分別命名為GhTGA1與GhTGA9.2，二者分別編碼405，486個氨基酸(圖1-A、圖2-A)，GhTGA1蛋白預(yù)測分子量為45.5 ku，等電點(diǎn)為6.29；GhTGA9.2蛋白預(yù)測分子量為54.2 ku，等電點(diǎn)為6.64。GhTGA1與GhTGA9.2蛋白的BRLZ(Basic Region Leucin Zippper BRLZ或bZIP)保守結(jié)構(gòu)域分別位于121-170與183-235氨基酸，除bZIP結(jié)構(gòu)域外，分析表明，2個基因均含有DOG1結(jié)構(gòu)域(圖1-C、圖2-C)。因此，這2個基因?qū)儆赽ZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白亞家族TGA家族基因。利用GOR4程序預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析表明，GhTGA1與GhTGA9.2蛋白中α螺旋分別為57.78%和47.74%，延伸帶分別為13.83%和13.99%，無規(guī)則卷曲占28.40%和38.27%(圖1-D、圖2-D)；利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GhTGA1與GhTGA9.2蛋白三級結(jié)構(gòu)分析(圖1-E、圖2-E)，其三級結(jié)構(gòu)主要為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋。

A.GhTGA1基因推導(dǎo)的氨基酸序列；下劃線.bZIP結(jié)構(gòu)域；方框.DOG1結(jié)構(gòu)域；B.GhTGA1基因PCR擴(kuò)增；M.DL2000；1.陰性對照；2.cDNA為模板的PCR擴(kuò)增；C.GhTGA1基因蛋白結(jié)構(gòu)分析；D.GhTGA1基因編碼的氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)分析；最長豎線.α螺旋；中長豎線.延伸帶；最短豎線.無規(guī)則卷曲；E.GhTGA1基因編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)分析。

A.The amino acid sequence deduced fromGhTGA1 gene；Underline.bZIP domain；Box.DOG1 domain；B.PCR ofGhTGA1 from genome cDNA；M. DL2000；1.Negative control；2.PCR amplification of cDNA as a template；C. Protein structure ofGhTGA1 gene analysis；D.Analysis of two grade structure of amino acid sequence encoded byGhTGA1 gene；Alpha helix.Extended strand and random coil are represented by the longest，the second longest and the shortest vertical bars，respectively；E.Protein tertiary structure ofGhTGA1 gene analysis.

圖1GhTGA1基因擴(kuò)增及氨基酸序列分析
Fig.1PCRamplificationresultsofGhTGA1geneandaminoacidsequenceanalysis

A.GhTGA9.2基因推導(dǎo)的氨基酸序列；下劃線.bZIP結(jié)構(gòu)域；方框.DOG1結(jié)構(gòu)域；B.GhTGA9.2基因PCR擴(kuò)增；M.DL2000；1.陰性對照；2.cDNA為模板的PCR擴(kuò)增。C.GhTGA9.2基因基因蛋白結(jié)構(gòu)分析； D.GhTGA9.2基因編碼的氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)分析；最長豎線.α螺旋；中長豎線.延伸帶；最短豎線.無規(guī)則卷曲。E.GhTGA9.2基因編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)分析。

A.The amino acid sequence deduced fromGhTGA9.2 gene；Underline.bZIP domain；Box.DOG1 domain；B.PCR ofGhTGA9.2 from genome cDNA；M. DL2000；1.Negative control；2.PCR amplification of cDNA as a template.C.Protein structure ofGhTGA9.2 gene analysis；D.Analysis of two grade structure of amino acid sequence encoded byGhTGA9.2 gene；Alpha helix，extended strand and random coil are represented by the longest，the second longest and the shortest vertical bars，respectively.E.Protein tertiary structure ofGhTGA9.2 gene analysis.

圖2GhTGA9.2基因擴(kuò)增及蛋白序列分析
Fig.2PCRamplificationresultsofGhTGA9.2geneandaminoacidsequenceanalysis

2.2 GhTGA1與GhTGA9.2基因同源進(jìn)化分析

利用Blast程序分別對GhTGA1與GhTGA9.2基因進(jìn)行同源比對分析，選取E-value較高的序列，其登錄號為：NM_125919.3(AtTGA1)、EF470806(AtTGA2)、NM_102057(AtTGA3)、NM_001343084(AtTGA4)、NM_001342914 (AtTGA5)、NM_202564(AtTGA6)、NM_106441(AtTGA7)、NM_105536(AtTGA8)、 NM_001331769.1(AtTGA9)、 NM_001203315(AtTGA10)、U90214.1(NtTGA2.1)、AF031487.1 (NtTGA2.2)、 XM_016591187(NtTGA1A)，利用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件Mega 5.0對目的基因和上述基因進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系比較，分析表明，GhTGA1基因與NM_125919.3(AtTGA1)親緣關(guān)系較近，命名該基因為GhTGA1，GhTGA9.2基因與NM_001331769.1(AtTGA9)親緣關(guān)系較近，但棉花中已有GhTGA9 和GhTGA9.1，命名該基因為GhTGA9.2(圖3)。

黑菱形.GhTGA9.2；黑三角形.GhTGA1；圖中分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比。 Black diamond.GhTGA9.2；Black triangle.GhTGA1；The numbers on the branches represent the reliability percent of Bootstrap values based on 1 000 replications.

2.3 GhTGA1和TGA9.2表達(dá)特征分析

利用實時熒光定量技術(shù)進(jìn)行枯萎病菌接菌后GhTGA1和TGA9.2轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)水平分析，結(jié)果顯示，在抗病品種中棉所 12 號中，二者均能被枯萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)量變化趨勢不同，GhTGA1基因表達(dá)量在處理時間內(nèi)均高于 Mock，隨處理時間延長，呈先升高后下降趨勢，處理6 h時表達(dá)量最高(圖4-A)，GhTGA9.2表達(dá)量在各個處理時間點(diǎn)均低于Mock，且各處理時間點(diǎn)之間表達(dá)量變化不明顯，呈下調(diào)表達(dá)趨勢(圖4-B)。

植物激素是植物體抗病信號通路的重要信號分子，本試驗分別在棉花苗期用乙烯(ET)、茉莉酸(JA)以及水楊酸(SA)對中棉所 12 號進(jìn)行處理，結(jié)果表明，GhTGA1和GhTGA9.2基因均能在不程度響應(yīng)激素脅迫應(yīng)答，ET處理后，GhTGA1和GhTGA9.2基因表達(dá)量變化趨勢相似，均表現(xiàn)為先增加后降低趨勢，但GhTGA1基因表達(dá)量在處理24 h表達(dá)量達(dá)到最大值，約為此處理點(diǎn)Mock的12倍(圖4-C)，預(yù)示著GhTGA1可能在響應(yīng)ET誘導(dǎo)后期發(fā)揮重要作用；GhTGA9.2基因整體表達(dá)量均高于Mock，在處理3 h表達(dá)量最高為1.1，較Mock而言，響應(yīng)并不明顯(圖4-D)；JA處理后，在處理2 h，GhTGA1基因表達(dá)量迅速升高，且表達(dá)量最高，隨處理時間推移，逐漸下降(圖4-E)，而GhTGA9.2基因隨處理時間變化，與Mock相比，表達(dá)量維持在較高水平(圖4-F)，表明GhTGA1和GhTGA9.2對JA脅迫應(yīng)答響應(yīng)明顯，推測在棉花中GhTGA1和GhTGA9.2參與JA信號途徑。SA處理后，GhTGA1和GhTGA9.2表達(dá)情況截然相反，GhTGA1對SA脅迫表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控，每個處理時間點(diǎn)，其表達(dá)量均低于Mock(圖4-G)，而GhTGA9.2表達(dá)受SA誘導(dǎo)后，其表達(dá)量的變化趨勢為先上升再下降，處理3 h表達(dá)量最高，各處理時間點(diǎn)表達(dá)量均高于Mock(圖4-H)，表明該基因能夠響應(yīng)SA脅迫應(yīng)答，且呈正調(diào)控。

圖4 GhTGA1與GhTGA9.2基因在不同脅迫處理下表達(dá)特征分析Fig.4 Expression analysis of GhTGA1 and GhTGA9.2 gene under different treatments in cotton

3 結(jié)論與討論

棉花是重要的紡織品、飼料、生物能源等原料，而海島棉(GossypiumbarbadenseLinn)纖維潔白細(xì)長，強(qiáng)度高，受紡織行業(yè)青睞[19]，新疆作為我國海島棉唯一產(chǎn)區(qū)，近年來因枯萎病發(fā)病嚴(yán)重，制約了海島棉的生產(chǎn)。因此，培育或創(chuàng)制抗枯萎病海島棉種質(zhì)資源是當(dāng)前的主要目標(biāo)。眾多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與了植物的發(fā)育、抗逆、衰老等過程，且在這些生理過程中起關(guān)鍵作用，而利用植物基因工程技術(shù)創(chuàng)制棉花抗病耐逆新材料成為研究熱點(diǎn)[19-20]。本研究在利用前期高通量測序技術(shù)獲得表達(dá)普數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法，以篩選出的差異表達(dá) bZIP 序列為探針，獲得2個 ORF 完整的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，GhTGA1與擬南芥AtTGA1親緣關(guān)系較近，GhTGA9.2與擬南芥AtTGA9親緣關(guān)系較近，推測GhTGA1與GhTGA9.2基因?qū)儆诿藁?bZIP 家族的亞家族TGA 轉(zhuǎn)錄因子。

研究表明，不同的棉花TGA轉(zhuǎn)錄因子參與不同的發(fā)育過程和代謝途徑[21-22]，研究棉花TGA轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)特征有助于揭示它們的功能，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組中共有 10 個 TGA 轉(zhuǎn)錄因子，依據(jù)其序列相似性可將其分為 5 組(Ⅰ組包含TGA1 與TGA4；TGA2、TGA5 與TGA6 組成第Ⅱ組；TGA3 與TGA7 組成第Ⅲ組；TGA9 和TGA10 構(gòu)成第Ⅳ組；PAN 為第Ⅴ組)。其中Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ組成員廣泛參與植株的抗病反應(yīng)，Ⅳ與Ⅴ組對植物花器官發(fā)育具有重要的調(diào)控功能[23]，利用實時熒光定量技術(shù)分析病原菌誘導(dǎo)后GhTGA1與GhTGA9.2基因表達(dá)特征，結(jié)果表明，GhTGA1在抗病品種中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測GhTGA1基因可能在棉花對枯萎病菌的抗性是正調(diào)控作用，而此結(jié)果與小麥中條銹病處理后TaTGA2.2 基因的上調(diào)表達(dá)一致，而GhTGA9.2在抗病品種中呈下調(diào)表達(dá)，推測該基因可能負(fù)調(diào)控棉花對枯萎病的抗性。目前，關(guān)于植物對病原體的防御以及防御基因的表達(dá)過程中，植物激素分子水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等作為植物抗病信號的重要分子發(fā)揮重要作用，而該過程中可能需要2種或2種以上信號通路協(xié)同作用，實現(xiàn)植物的抗病性[24-25]。本試驗通過外源激素分子處理棉花，利用qRT-PCR分析GhTGA1與GhTGA9.2在激素誘導(dǎo)后的表達(dá)模式，在乙烯和茉莉酸處理后，GhTGA1與GhTGA9.2基因表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，表明二者在棉花中可以被JA和ET誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，此結(jié)果與湖北海棠MhTGA2基因可以被MeJA和ACC誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果一致[26]，推測它們可能同時參與JA和ET信號路徑；水楊酸處理后，GhTGA1基因為下調(diào)表達(dá)，而GhTGA9.2受SA誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，Zhang等[27]用外源的SA、 MeJA和ET誘導(dǎo)小麥，結(jié)果表明， MeJA和ET這2個激素可以誘導(dǎo)TabZIP1的表達(dá)，SA卻不能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，而馮傳欣[24]對小麥進(jìn)行水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)誘導(dǎo)，結(jié)果表明，二者均能使TaTGA2.2 基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步說明不同的基因通過不同的信號途徑參與植物響應(yīng)不同的脅迫應(yīng)答。

綜上所述，TGA轉(zhuǎn)錄因子基因在植物的生長及脅迫應(yīng)答等生理過程中發(fā)揮重要作用，關(guān)于棉花中TGA轉(zhuǎn)錄因子研究與報道甚少。本研究以石河子大學(xué)長絨棉育種課題組利用Solexa高通量測序技術(shù)建立了枯萎病菌誘導(dǎo)棉花幼苗根部不同時間的基因表達(dá)譜為基礎(chǔ)，從抗枯萎病菌的中棉所 12 號中克隆到了GhTGA1與GhTGA9.2基因，并通過qRT-PCR技術(shù)分析了GhTGA1與GhTGA9.2基因的表達(dá)特征，為后續(xù)棉花遺傳轉(zhuǎn)化驗證基因功能奠定了基礎(chǔ)。