陳張彬，張振乾，2，陳 浩，劉忠松，2，熊興華， 鄔賢夢，2，官 梅，2，陳社員，官春云，肖 鋼，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

我國是世界上油菜栽培面積最大的國家，年產(chǎn)菜籽維持在1 200萬t以上，目前，菜籽油占我國植物油消費(fèi)的40%[1]。草害和蟲害是目前世界油菜生產(chǎn)上影響菜籽產(chǎn)量的兩大問題。我國冬油菜一般在9-10月份播種。此段時間雜草生長迅速，油菜幼苗往往競爭不過雜草，造成油菜生長弱小甚至死亡，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量。研究表明，長江下游地區(qū)冬油菜田草害面積達(dá)種植面積的 46.9%，一般年份會造成油菜減產(chǎn) 10%～20%，草害嚴(yán)重時甚至減產(chǎn)50%以上[2]。另外，田間雜草是多種油菜害蟲和病菌的宿主，雜草多的田塊往往油菜病蟲害發(fā)生更嚴(yán)重。我國油菜以冬油菜為主，蟲害較其他春夏生長的作物要輕。但在苗期菜青蟲、猿葉蟲等鱗翅目、鞘翅目害蟲造成的危害也不小。通過導(dǎo)入外源抗性基因的方法，使油菜產(chǎn)生除草劑抗性和抗蟲性，既節(jié)省了勞動力又減少雜草和病蟲害對油菜產(chǎn)量的影響，無疑是一個低成本且行之有效的方法。

草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)，來源于吸水鏈霉菌，該基因作為篩選標(biāo)記已被廣泛運(yùn)用于基因工程領(lǐng)域，含有該基因的油菜在加拿大、巴西、阿根廷、澳大利亞等國家已批準(zhǔn)大規(guī)模種植[3]。由于種植了抗除草劑油菜，2000-2013年，加拿大油菜單產(chǎn)從1 330 kg/hm2增加到 2 025 kg/hm2[4]。在加拿大種植抗除草劑油菜的收益比普通油菜高13%左右[5-6]。種植抗除草劑油菜增加加拿大菜籽的國際市場競爭力，使加拿大成為全球最大的菜籽出口國。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是目前最成功的用于防治害蟲的昆蟲病原菌。其殺蟲能力來自菌體內(nèi)的Bt毒蛋白，目前共報道了500多個Bt毒蛋白，該蛋白是Bt菌內(nèi)芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白，可與昆蟲腸道的特異性受體結(jié)合，引起細(xì)胞膜穿孔，破壞細(xì)胞滲透平衡，細(xì)胞腫脹破裂，最終導(dǎo)致昆蟲停止進(jìn)食繼而殺死害蟲[7]。由于動物腸道無該特異性受體，因此，普遍認(rèn)為，Bt毒蛋白對動物無不良影響[8]。研究已證實(shí)，Bt毒蛋白對鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、直翅目(Orthoptera)、雙翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)多種昆蟲，以及線蟲、原生動物和螨類等均具有特異性的殺蟲活性[9-13]。Bt毒蛋白已被廣泛運(yùn)用在植物抗蟲研究中，目前，Bt抗蟲棉和玉米在全球的廣泛商業(yè)化種植，極大地減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用及生產(chǎn)成本。

本研究所用Bt毒蛋白基因cry1ab/ac(GenBank序列號EU816953)是由cry1ab基因(GenBank序列號X54939)和cry1ac基因(GenBank序列號Y09787)融合而成[14]，其編碼的毒蛋白Cry1Ab/Ac對鱗翅目害蟲有很高的毒性。在cry1ab/ac基因之前，還加上了來源于擬南芥的基因表達(dá)增強(qiáng)子序列(擬南芥乙醇脫氫酶基因5′-UTR序列，The 5′-UTR sequence ofAtADHgene)，以增加cry1ab/ac在油菜中的表達(dá)量。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，得到了轉(zhuǎn)bar和轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因的油菜材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：受體油菜材料為湘油15。

載體和菌株：pFGC5491植物表達(dá)載體、大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3103為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所保存。

基因和引物：cry1ab/ac融合基因(EU816953)經(jīng)密碼子優(yōu)化以適合在甘藍(lán)型油菜中表達(dá)，AtADH5′-UTR序列信息來自植物表達(dá)載體pRI101.AN(TaKaRa，日本)。AtADH5′-UTR連接cry1ab/ac之前，DNA序列由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。根據(jù)優(yōu)化后的cry1ab/ac基因和pFGC5491載體(AY310901)上的bar基因序列設(shè)計特異性檢測引物，cry1-F：5′-AGGCAAGGATTCTCCCACAGGT-3′，cry1-R：5′-TGGTAGATGTGGATGGGAAGTG-3′，產(chǎn)物大小390 bp；bar-F：5′-AGATC TCGGTGACGGGCAGGAC-3′，bar-R：5′-GGACTGGGCTCCACGCTCTACAC-3′，產(chǎn)物大小250 bp。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Bt毒蛋白基因表達(dá)載體pFGC-Bt的構(gòu)建和農(nóng)桿菌工程菌的制備 合成cry1ab/ac融合基因和AtADH5′-UTR，加入BamH Ⅰ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)。將合成片段用BamH Ⅰ和NcoⅠ酶切，與用同樣酶切處理的pFGC5491植物表達(dá)載體用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成Bt毒蛋白基因表達(dá)載體pFGC-Bt。利用凍融法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

1.2.2 植物表達(dá)載體pFGC-Bt在油菜中的遺傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化法，取萌發(fā)好的油菜種子用無菌解剖刀將下胚軸切為0.8～1.0 cm的小段。將切好的外植體完全浸泡入菌液中30 min后轉(zhuǎn)移到鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，23 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。將共培養(yǎng)后的外植體放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，24 ℃，光照16 h/黑暗8 h。以0.4%濃度的除草劑basta(草銨膦)為篩選壓，14 d繼代一次。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，24 ℃，光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng)，14 d繼代一次直至出現(xiàn)綠苗。28 d后將愈傷當(dāng)幼莖抵抗篩選壓生長到3～4 cm 時，切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)14～28 d。

1.2.3 除草劑篩選T1轉(zhuǎn)化植株 表達(dá)載體pFGC-Bt上帶有除草劑基因bar，因此，轉(zhuǎn)基因植株也會具備一定的除草劑抗性。將T0植株上的種子都收下，播種在盆中，待苗長至二～三葉期時，用0.6%的basta溶液噴灑幼苗，沒有死亡的植株留作下一步檢測。另外，以0.6%的basta溶液噴灑種在田間的非轉(zhuǎn)基因植株湘油15作為陰性對照。

1.2.4 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株：選取表現(xiàn)為basta抗性的植株，CTAB法提取轉(zhuǎn)化植株總DNA，利用引物cry1-F、cry1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s ，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 雙抗體夾心免疫層析技術(shù)檢測Cry1Ab/Ac毒蛋白 使用武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Bt轉(zhuǎn)基因Cry1Ab/Ac毒蛋白快速檢測試紙檢測轉(zhuǎn)基因植株是否表達(dá)Cry1Ab/Ac毒蛋白。試劑盒對Cry1Ab/Ac毒蛋白的檢測限是100 ng/mL。取1 g油菜幼嫩葉片放入研缽，加上1 mL試劑盒所帶的蛋白提取液，研磨后將勻漿轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min。取上清液進(jìn)行檢測，具體操作見產(chǎn)品說明書。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因油菜離體抗蟲檢測 溫室內(nèi)播種湘油15號和T1轉(zhuǎn)基因油菜，待其生長至5～6片真葉時，取油菜同一部位健康、無病蟲害葉片(盡量保證所采葉片大小、老嫩程度一致)。葉片采摘后，立即放入預(yù)先鋪有雙層濾紙(用無菌水保濕)的培養(yǎng)皿中，取非轉(zhuǎn)基因油菜飼喂的10日齡菜青蟲，按照1頭/皿接種，3日后統(tǒng)計葉片損傷及幼蟲發(fā)育情況(每個株系生物學(xué)重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.2.7 種子品質(zhì)分析 菜籽的含油量、脂肪酸組成和硫代葡萄糖苷含量決定其品質(zhì)。通過索氏抽提法(NY/T 4-1982)和近紅外光譜技術(shù)對菜籽的上述指標(biāo)進(jìn)行了測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因的獲得及basta 篩選轉(zhuǎn)化植株

以甘藍(lán)型油菜湘油15下胚軸為外植體，通過農(nóng)桿菌侵染、愈傷組織分化出苗、生根培養(yǎng)等步驟，本研究獲得了7株T0轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因油菜再生苗(圖1)。將7株苗上的種子分株收獲，全部播種在花盆中，待2～3片葉時，噴灑0.6%的除草劑basta溶液，有部分T1幼苗存活下來(圖2)。作為對照，湘油15油菜噴灑0.6%的basta后全部死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)草銨膦噴灑存活下來的T1轉(zhuǎn)基因油菜植株為陽性植株，轉(zhuǎn)bar基因的轉(zhuǎn)基因油菜植株對草銨磷具有很好的抗性(圖3)。

A.油菜種子萌發(fā)；B.下胚軸外植體； C.愈傷組織形成； D.愈傷組織分化成苗；E.轉(zhuǎn)基因苗。 A.Rapeseed germination;B.Hypocotyl explants;C.Callus formation; D.CallusDifferentiation into seedlings;E.Transgenic seedlings.

圖2 除草劑basta處理T1轉(zhuǎn)基因油菜Fig.2 basta treatment to T1 basta-resistant rape

圖3 除草劑basta處理湘油15Fig.3 basta treatment to Xiangyou 15

2.2 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株

用CTAB法提取8株T1轉(zhuǎn)化苗的總DNA，以此為模板，用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠檢測，以湘油15為陰性對照，重組質(zhì)粒pFGC-Bt為陽性對照。凝膠電泳結(jié)果顯示，從8株轉(zhuǎn)基因苗中都擴(kuò)增出cry1ab/ac和bar基因目的片段(圖4)，說明cry1ab/ac和bar基因已被成功轉(zhuǎn)化到油菜中。

2.3 Cry1Ab/Ac毒蛋白定性檢測

Bt轉(zhuǎn)基因Cry1Ab/Ac毒蛋白快速檢測試紙應(yīng)用雙抗體夾心免疫層析的原理，在樣品泳動過程中，樣品中的抗原先與膠體金標(biāo)記的抗體A結(jié)合，繼而與檢測線上特異性單克隆抗體B結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物。如果樣本中抗原含量大于限量，對照線(Control line)和檢測線(Test line)顯紅色，結(jié)果為陽性；反之，只有對照線顯紅色，而檢測線不顯色，結(jié)果為陰性。從圖5可以看到，11個轉(zhuǎn)基因材料的對照線和檢測線都顯紅色，說明在這11株轉(zhuǎn)基因油菜中都檢測到有Cry1Ab/Ac蛋白表達(dá)。

A.cry1ab/ac基因；B.bar基因；M.1 000 bp DNA Marker； 1.陰性對照；2-9.轉(zhuǎn)基因植株；10.陽性對照。 A.cry1ab/ac gene；B.bar gene；M.1 000 bp DNA Marker；1.Negative control；2-9.Transgenic plant；10.Positive control.

1.陰性對照(非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15)；2.陰性對照(蛋白提取液)； 3-13.轉(zhuǎn)基因油菜。 1. Negative control(Non-transgenic rape Xiangyou 15)； 2.Negative control(Protein extract)；3-13.Genetically modified rape.

2.4 轉(zhuǎn)基因油菜離體抗蟲性初步檢測

將菜青蟲接種在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上，以非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15葉片為對照。觀察發(fā)現(xiàn)，菜青蟲在湘油15葉片上繼續(xù)啃食葉片，而在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上的菜青蟲啃食幾口葉片就不再啃食葉片，并且停止爬動。3 d后，湘油15葉片基本上被菜青蟲啃食干凈(圖6-A)，而轉(zhuǎn)基因油菜葉片基本完整(圖6-B)。此時，湘油15上的菜青蟲活動性強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)基因油菜上的菜青蟲則蟄伏在葉片背面，只在鑷子觸碰時才會稍微扭動身軀，且個頭明顯比湘油15葉片上的菜青蟲要小。7 d左右，轉(zhuǎn)基因葉片上的菜青蟲用鑷子觸碰完全沒有反應(yīng)，已經(jīng)死亡。該試驗(yàn)結(jié)果說明，轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因油菜對菜青蟲具有高度抗性。

A.非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15；B.轉(zhuǎn)基因油菜。 A. Non-transgenic rape Xiangyou 15；B. Genetically modified rape.

2.5 轉(zhuǎn)基因油菜種子品質(zhì)分析

使用FOSS公司DS2500F型近紅外分析儀對8個轉(zhuǎn)基因材料和對照湘油15種子進(jìn)行了脂肪酸組成分析，使用索氏抽提法分析了轉(zhuǎn)基因材料和對照的含油量。從表1可以看出，轉(zhuǎn)基因油菜和對照湘油15在含油量、脂肪酸組成和硫苷含量上沒有顯著差異。

表1 轉(zhuǎn)基因油菜菜籽品質(zhì)分析Tab.1 Seed quality analysis in transgenic plants

注：脂肪酸含量=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)。脂肪酸含量中不同字母表示差異達(dá)到0.05顯著水平。

Note：Values=mean±s(n=3).Different letters indicate significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜目前在加拿大、澳大利亞、巴西、阿根廷等已被廣泛種植，并取得了很好的經(jīng)濟(jì)效益。加拿大學(xué)者多年的跟蹤研究也表明，種植耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜可以減少除草劑和殺蟲劑的使用量，同時也減少土地的翻耕次數(shù)，做到少耕甚至免耕，從而達(dá)到減少機(jī)械使用量，減少CO2排放和水土流失，達(dá)到環(huán)境保護(hù)的目的[15]。

Bt類微生物殺蟲劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物商業(yè)化應(yīng)用幾十年后，農(nóng)作物害蟲對Bt生物殺蟲劑或Bt毒蛋白抗性也已有大量報道，且這種抗性能夠遺傳給后代[16]。轉(zhuǎn)基因作物大田抗性試驗(yàn)證明，經(jīng)過12次繁殖后昆蟲便對Bt毒蛋白產(chǎn)生了抗性，轉(zhuǎn)單一Bt基因的作物在生產(chǎn)上一般只能用 8～10 年[17]。cry1ab/ac基因編碼615個氨基酸的融合蛋白，前448個氨基酸與CRY1Ab的類似區(qū)域基本相同，剩余的449～615個氨基酸與CRY1Ac蛋白相應(yīng)部分完全一致，沒有任何變化[18]。另一個避免昆蟲產(chǎn)生抗性的策略是“高劑量效應(yīng)”。研究人員發(fā)現(xiàn)，昆蟲在對殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性，主要是由于昆蟲長期取食低劑量殺蟲蛋白，在保證存活的狀態(tài)下產(chǎn)生的[19]?！案邉┝啃?yīng)” 即通過提高抗蟲農(nóng)作物中的殺蟲蛋白表達(dá)量，使昆蟲取食后全部死亡，從而避免抗性昆蟲的產(chǎn)生。本研究中，在融合基因上游加上擬南芥乙醇脫氫酶5′-UTR序列，該序列能夠顯著提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量。在安全性方面，Xu等[20]對Cry1Ab/Ac融合蛋白進(jìn)行了安全性評估，其結(jié)論認(rèn)為，Cry1Ab/Ac蛋白存在于人類食物或動物飼料中是無害的。目前，cry1ab/ac基因已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻、棉花、玉米、大豆等作物[21-24]。

本研究中，成功將人工合成殺蟲基因cry1ab/ac插入到含有抗除草劑基因bar的植物表達(dá)載體pFGC5941上，構(gòu)建了同時具備殺蟲基因cry1ab/ac和抗除草劑基因bar的重組質(zhì)粒pFGC-Bt，并利用凍融法導(dǎo)入大腸桿菌中，搖菌擴(kuò)繁后提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并利用陽性的農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)型油菜外植體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜湘油15中，得到了轉(zhuǎn)基因植株，初步的除草劑噴灑試驗(yàn)和飼蟲試驗(yàn)表明，其對草銨膦和菜青蟲具有很好的抗性，本研究為進(jìn)一步培育抗除草劑、抗蟲轉(zhuǎn)基因油菜新品種創(chuàng)造了新種質(zhì)。