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        農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗除草劑基因bar和抗蟲基因cry1ab/ac 轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜的研究

        2018-11-01 08:24:12陳張彬張振乾劉忠松熊興華鄔賢夢陳社員官春云
        華北農(nóng)學(xué)報 2018年5期
        關(guān)鍵詞:菜青蟲除草劑抗性

        陳張彬,張振乾,2,陳 浩,劉忠松,2,熊興華, 鄔賢夢,2,官 梅,2,陳社員,官春云,肖 鋼,2

        (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

        我國是世界上油菜栽培面積最大的國家,年產(chǎn)菜籽維持在1 200萬t以上,目前,菜籽油占我國植物油消費的40%[1]。草害和蟲害是目前世界油菜生產(chǎn)上影響菜籽產(chǎn)量的兩大問題。我國冬油菜一般在9-10月份播種。此段時間雜草生長迅速,油菜幼苗往往競爭不過雜草,造成油菜生長弱小甚至死亡,嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量。研究表明,長江下游地區(qū)冬油菜田草害面積達(dá)種植面積的 46.9%,一般年份會造成油菜減產(chǎn) 10%~20%,草害嚴(yán)重時甚至減產(chǎn)50%以上[2]。另外,田間雜草是多種油菜害蟲和病菌的宿主,雜草多的田塊往往油菜病蟲害發(fā)生更嚴(yán)重。我國油菜以冬油菜為主,蟲害較其他春夏生長的作物要輕。但在苗期菜青蟲、猿葉蟲等鱗翅目、鞘翅目害蟲造成的危害也不小。通過導(dǎo)入外源抗性基因的方法,使油菜產(chǎn)生除草劑抗性和抗蟲性,既節(jié)省了勞動力又減少雜草和病蟲害對油菜產(chǎn)量的影響,無疑是一個低成本且行之有效的方法。

        草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar),來源于吸水鏈霉菌,該基因作為篩選標(biāo)記已被廣泛運用于基因工程領(lǐng)域,含有該基因的油菜在加拿大、巴西、阿根廷、澳大利亞等國家已批準(zhǔn)大規(guī)模種植[3]。由于種植了抗除草劑油菜,2000-2013年,加拿大油菜單產(chǎn)從1 330 kg/hm2增加到 2 025 kg/hm2[4]。在加拿大種植抗除草劑油菜的收益比普通油菜高13%左右[5-6]。種植抗除草劑油菜增加加拿大菜籽的國際市場競爭力,使加拿大成為全球最大的菜籽出口國。

        蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是目前最成功的用于防治害蟲的昆蟲病原菌。其殺蟲能力來自菌體內(nèi)的Bt毒蛋白,目前共報道了500多個Bt毒蛋白,該蛋白是Bt菌內(nèi)芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白,可與昆蟲腸道的特異性受體結(jié)合,引起細(xì)胞膜穿孔,破壞細(xì)胞滲透平衡,細(xì)胞腫脹破裂,最終導(dǎo)致昆蟲停止進(jìn)食繼而殺死害蟲[7]。由于動物腸道無該特異性受體,因此,普遍認(rèn)為,Bt毒蛋白對動物無不良影響[8]。研究已證實,Bt毒蛋白對鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、直翅目(Orthoptera)、雙翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)多種昆蟲,以及線蟲、原生動物和螨類等均具有特異性的殺蟲活性[9-13]。Bt毒蛋白已被廣泛運用在植物抗蟲研究中,目前,Bt抗蟲棉和玉米在全球的廣泛商業(yè)化種植,極大地減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用及生產(chǎn)成本。

        本研究所用Bt毒蛋白基因cry1ab/ac(GenBank序列號EU816953)是由cry1ab基因(GenBank序列號X54939)和cry1ac基因(GenBank序列號Y09787)融合而成[14],其編碼的毒蛋白Cry1Ab/Ac對鱗翅目害蟲有很高的毒性。在cry1ab/ac基因之前,還加上了來源于擬南芥的基因表達(dá)增強子序列(擬南芥乙醇脫氫酶基因5′-UTR序列,The 5′-UTR sequence ofAtADHgene),以增加cry1ab/ac在油菜中的表達(dá)量。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,得到了轉(zhuǎn)bar和轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因的油菜材料。

        1 材料和方法

        1.1 試驗材料

        植物材料:受體油菜材料為湘油15。

        載體和菌株:pFGC5491植物表達(dá)載體、大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3103為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所保存。

        基因和引物:cry1ab/ac融合基因(EU816953)經(jīng)密碼子優(yōu)化以適合在甘藍(lán)型油菜中表達(dá),AtADH5′-UTR序列信息來自植物表達(dá)載體pRI101.AN(TaKaRa,日本)。AtADH5′-UTR連接cry1ab/ac之前,DNA序列由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。根據(jù)優(yōu)化后的cry1ab/ac基因和pFGC5491載體(AY310901)上的bar基因序列設(shè)計特異性檢測引物,cry1-F:5′-AGGCAAGGATTCTCCCACAGGT-3′,cry1-R:5′-TGGTAGATGTGGATGGGAAGTG-3′,產(chǎn)物大小390 bp;bar-F:5′-AGATC TCGGTGACGGGCAGGAC-3′,bar-R:5′-GGACTGGGCTCCACGCTCTACAC-3′,產(chǎn)物大小250 bp。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 Bt毒蛋白基因表達(dá)載體pFGC-Bt的構(gòu)建和農(nóng)桿菌工程菌的制備 合成cry1ab/ac融合基因和AtADH5′-UTR,加入BamH Ⅰ和NcoⅠ酶切位點。將合成片段用BamH Ⅰ和NcoⅠ酶切,與用同樣酶切處理的pFGC5491植物表達(dá)載體用T4DNA連接酶連接,構(gòu)建成Bt毒蛋白基因表達(dá)載體pFGC-Bt。利用凍融法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

        1.2.2 植物表達(dá)載體pFGC-Bt在油菜中的遺傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化法,取萌發(fā)好的油菜種子用無菌解剖刀將下胚軸切為0.8~1.0 cm的小段。將切好的外植體完全浸泡入菌液中30 min后轉(zhuǎn)移到鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,23 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。將共培養(yǎng)后的外植體放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,24 ℃,光照16 h/黑暗8 h。以0.4%濃度的除草劑basta(草銨膦)為篩選壓,14 d繼代一次。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中,24 ℃,光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng),14 d繼代一次直至出現(xiàn)綠苗。28 d后將愈傷當(dāng)幼莖抵抗篩選壓生長到3~4 cm 時,切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)14~28 d。

        1.2.3 除草劑篩選T1轉(zhuǎn)化植株 表達(dá)載體pFGC-Bt上帶有除草劑基因bar,因此,轉(zhuǎn)基因植株也會具備一定的除草劑抗性。將T0植株上的種子都收下,播種在盆中,待苗長至二~三葉期時,用0.6%的basta溶液噴灑幼苗,沒有死亡的植株留作下一步檢測。另外,以0.6%的basta溶液噴灑種在田間的非轉(zhuǎn)基因植株湘油15作為陰性對照。

        1.2.4 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株:選取表現(xiàn)為basta抗性的植株,CTAB法提取轉(zhuǎn)化植株總DNA,利用引物cry1-F、cry1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s ,35個循環(huán);72 ℃ 5 min),1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

        1.2.5 雙抗體夾心免疫層析技術(shù)檢測Cry1Ab/Ac毒蛋白 使用武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Bt轉(zhuǎn)基因Cry1Ab/Ac毒蛋白快速檢測試紙檢測轉(zhuǎn)基因植株是否表達(dá)Cry1Ab/Ac毒蛋白。試劑盒對Cry1Ab/Ac毒蛋白的檢測限是100 ng/mL。取1 g油菜幼嫩葉片放入研缽,加上1 mL試劑盒所帶的蛋白提取液,研磨后將勻漿轉(zhuǎn)入2 mL離心管中,2 000 r/min離心5 min。取上清液進(jìn)行檢測,具體操作見產(chǎn)品說明書。

        1.2.6 轉(zhuǎn)基因油菜離體抗蟲檢測 溫室內(nèi)播種湘油15號和T1轉(zhuǎn)基因油菜,待其生長至5~6片真葉時,取油菜同一部位健康、無病蟲害葉片(盡量保證所采葉片大小、老嫩程度一致)。葉片采摘后,立即放入預(yù)先鋪有雙層濾紙(用無菌水保濕)的培養(yǎng)皿中,取非轉(zhuǎn)基因油菜飼喂的10日齡菜青蟲,按照1頭/皿接種,3日后統(tǒng)計葉片損傷及幼蟲發(fā)育情況(每個株系生物學(xué)重復(fù)3次,試驗重復(fù)3次)。

        1.2.7 種子品質(zhì)分析 菜籽的含油量、脂肪酸組成和硫代葡萄糖苷含量決定其品質(zhì)。通過索氏抽提法(NY/T 4-1982)和近紅外光譜技術(shù)對菜籽的上述指標(biāo)進(jìn)行了測定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 轉(zhuǎn)基因的獲得及basta 篩選轉(zhuǎn)化植株

        以甘藍(lán)型油菜湘油15下胚軸為外植體,通過農(nóng)桿菌侵染、愈傷組織分化出苗、生根培養(yǎng)等步驟,本研究獲得了7株T0轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因油菜再生苗(圖1)。將7株苗上的種子分株收獲,全部播種在花盆中,待2~3片葉時,噴灑0.6%的除草劑basta溶液,有部分T1幼苗存活下來(圖2)。作為對照,湘油15油菜噴灑0.6%的basta后全部死亡。試驗結(jié)果表明,經(jīng)草銨膦噴灑存活下來的T1轉(zhuǎn)基因油菜植株為陽性植株,轉(zhuǎn)bar基因的轉(zhuǎn)基因油菜植株對草銨磷具有很好的抗性(圖3)。

        A.油菜種子萌發(fā);B.下胚軸外植體; C.愈傷組織形成; D.愈傷組織分化成苗;E.轉(zhuǎn)基因苗。 A.Rapeseed germination;B.Hypocotyl explants;C.Callus formation; D.CallusDifferentiation into seedlings;E.Transgenic seedlings.

        圖2 除草劑basta處理T1轉(zhuǎn)基因油菜Fig.2 basta treatment to T1 basta-resistant rape

        圖3 除草劑basta處理湘油15Fig.3 basta treatment to Xiangyou 15

        2.2 PCR檢測轉(zhuǎn)化植株

        用CTAB法提取8株T1轉(zhuǎn)化苗的總DNA,以此為模板,用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝膠檢測,以湘油15為陰性對照,重組質(zhì)粒pFGC-Bt為陽性對照。凝膠電泳結(jié)果顯示,從8株轉(zhuǎn)基因苗中都擴(kuò)增出cry1ab/ac和bar基因目的片段(圖4),說明cry1ab/ac和bar基因已被成功轉(zhuǎn)化到油菜中。

        2.3 Cry1Ab/Ac毒蛋白定性檢測

        Bt轉(zhuǎn)基因Cry1Ab/Ac毒蛋白快速檢測試紙應(yīng)用雙抗體夾心免疫層析的原理,在樣品泳動過程中,樣品中的抗原先與膠體金標(biāo)記的抗體A結(jié)合,繼而與檢測線上特異性單克隆抗體B結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物。如果樣本中抗原含量大于限量,對照線(Control line)和檢測線(Test line)顯紅色,結(jié)果為陽性;反之,只有對照線顯紅色,而檢測線不顯色,結(jié)果為陰性。從圖5可以看到,11個轉(zhuǎn)基因材料的對照線和檢測線都顯紅色,說明在這11株轉(zhuǎn)基因油菜中都檢測到有Cry1Ab/Ac蛋白表達(dá)。

        A.cry1ab/ac基因;B.bar基因;M.1 000 bp DNA Marker; 1.陰性對照;2-9.轉(zhuǎn)基因植株;10.陽性對照。 A.cry1ab/ac gene;B.bar gene;M.1 000 bp DNA Marker;1.Negative control;2-9.Transgenic plant;10.Positive control.

        1.陰性對照(非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15);2.陰性對照(蛋白提取液); 3-13.轉(zhuǎn)基因油菜。 1. Negative control(Non-transgenic rape Xiangyou 15); 2.Negative control(Protein extract);3-13.Genetically modified rape.

        2.4 轉(zhuǎn)基因油菜離體抗蟲性初步檢測

        將菜青蟲接種在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上,以非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15葉片為對照。觀察發(fā)現(xiàn),菜青蟲在湘油15葉片上繼續(xù)啃食葉片,而在轉(zhuǎn)基因油菜葉片上的菜青蟲啃食幾口葉片就不再啃食葉片,并且停止爬動。3 d后,湘油15葉片基本上被菜青蟲啃食干凈(圖6-A),而轉(zhuǎn)基因油菜葉片基本完整(圖6-B)。此時,湘油15上的菜青蟲活動性強,而在轉(zhuǎn)基因油菜上的菜青蟲則蟄伏在葉片背面,只在鑷子觸碰時才會稍微扭動身軀,且個頭明顯比湘油15葉片上的菜青蟲要小。7 d左右,轉(zhuǎn)基因葉片上的菜青蟲用鑷子觸碰完全沒有反應(yīng),已經(jīng)死亡。該試驗結(jié)果說明,轉(zhuǎn)cry1ab/ac基因油菜對菜青蟲具有高度抗性。

        A.非轉(zhuǎn)基因油菜湘油15;B.轉(zhuǎn)基因油菜。 A. Non-transgenic rape Xiangyou 15;B. Genetically modified rape.

        2.5 轉(zhuǎn)基因油菜種子品質(zhì)分析

        使用FOSS公司DS2500F型近紅外分析儀對8個轉(zhuǎn)基因材料和對照湘油15種子進(jìn)行了脂肪酸組成分析,使用索氏抽提法分析了轉(zhuǎn)基因材料和對照的含油量。從表1可以看出,轉(zhuǎn)基因油菜和對照湘油15在含油量、脂肪酸組成和硫苷含量上沒有顯著差異。

        表1 轉(zhuǎn)基因油菜菜籽品質(zhì)分析Tab.1 Seed quality analysis in transgenic plants

        注:脂肪酸含量=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,3次重復(fù)。脂肪酸含量中不同字母表示差異達(dá)到0.05顯著水平。

        Note:Values=mean±s(n=3).Different letters indicate significant difference at 0.05 level.

        3 結(jié)論與討論

        耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜目前在加拿大、澳大利亞、巴西、阿根廷等已被廣泛種植,并取得了很好的經(jīng)濟(jì)效益。加拿大學(xué)者多年的跟蹤研究也表明,種植耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜可以減少除草劑和殺蟲劑的使用量,同時也減少土地的翻耕次數(shù),做到少耕甚至免耕,從而達(dá)到減少機(jī)械使用量,減少CO2排放和水土流失,達(dá)到環(huán)境保護(hù)的目的[15]。

        Bt類微生物殺蟲劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物商業(yè)化應(yīng)用幾十年后,農(nóng)作物害蟲對Bt生物殺蟲劑或Bt毒蛋白抗性也已有大量報道,且這種抗性能夠遺傳給后代[16]。轉(zhuǎn)基因作物大田抗性試驗證明,經(jīng)過12次繁殖后昆蟲便對Bt毒蛋白產(chǎn)生了抗性,轉(zhuǎn)單一Bt基因的作物在生產(chǎn)上一般只能用 8~10 年[17]。cry1ab/ac基因編碼615個氨基酸的融合蛋白,前448個氨基酸與CRY1Ab的類似區(qū)域基本相同,剩余的449~615個氨基酸與CRY1Ac蛋白相應(yīng)部分完全一致,沒有任何變化[18]。另一個避免昆蟲產(chǎn)生抗性的策略是“高劑量效應(yīng)”。研究人員發(fā)現(xiàn),昆蟲在對殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性,主要是由于昆蟲長期取食低劑量殺蟲蛋白,在保證存活的狀態(tài)下產(chǎn)生的[19]?!案邉┝啃?yīng)” 即通過提高抗蟲農(nóng)作物中的殺蟲蛋白表達(dá)量,使昆蟲取食后全部死亡,從而避免抗性昆蟲的產(chǎn)生。本研究中,在融合基因上游加上擬南芥乙醇脫氫酶5′-UTR序列,該序列能夠顯著提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量。在安全性方面,Xu等[20]對Cry1Ab/Ac融合蛋白進(jìn)行了安全性評估,其結(jié)論認(rèn)為,Cry1Ab/Ac蛋白存在于人類食物或動物飼料中是無害的。目前,cry1ab/ac基因已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻、棉花、玉米、大豆等作物[21-24]。

        本研究中,成功將人工合成殺蟲基因cry1ab/ac插入到含有抗除草劑基因bar的植物表達(dá)載體pFGC5941上,構(gòu)建了同時具備殺蟲基因cry1ab/ac和抗除草劑基因bar的重組質(zhì)粒pFGC-Bt,并利用凍融法導(dǎo)入大腸桿菌中,搖菌擴(kuò)繁后提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,并利用陽性的農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)型油菜外植體,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜湘油15中,得到了轉(zhuǎn)基因植株,初步的除草劑噴灑試驗和飼蟲試驗表明,其對草銨膦和菜青蟲具有很好的抗性,本研究為進(jìn)一步培育抗除草劑、抗蟲轉(zhuǎn)基因油菜新品種創(chuàng)造了新種質(zhì)。

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