王海微，韓云飛，朱 琳，曲 悅，何沈雨，張忠臣，金正勛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

淀粉是水稻胚乳的主要成分，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，2種淀粉的比例及支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)等決定稻米產(chǎn)量和蒸煮食味品質(zhì)。在水稻胚乳中淀粉合成與積累過程非常復(fù)雜，涉及一系列的酶促反應(yīng)，其中，ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶是起主要作用的關(guān)鍵酶[1]，其酶基因的表達(dá)量及酶活性大小對淀粉合成積累和淀粉品質(zhì)影響都很大。基因的表達(dá)量和酶活性以及酶活性與淀粉合成積累和結(jié)構(gòu)等都有密切關(guān)系。基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子等調(diào)控基因的控制，是真核生物在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要途徑[2]。轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白，通過與目的基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件(cis-acting factor)發(fā)生相互作用，激活或抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。如WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因SUSIBA2在大麥胚乳灌漿過程中特異性激活異淀粉酶基因ios1和淀粉分支酶基因sbeⅡb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，能夠促進(jìn)大麥淀粉的合成[3]；利用反義寡核苷酸技術(shù)抑制SUSIBA2基因的活性后isol和sbeⅡb基因的表達(dá)量降低，從而影響淀粉的合成[4]。自1987年玉米轉(zhuǎn)錄因子被首次報(bào)道后[5]，數(shù)百種參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及各種代謝、激素應(yīng)答、抗病、干旱、高鹽、低溫等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相繼被分離出來[2]，其中，MYB、AP2/EREBP、bHLH、Zinc finger、HB、PHD、NAC以及WRKY等是植物基因組中的主要類型[6]。OsRSR1(Rice starch regulator1)基因編碼的蛋白是水稻眾多轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)，是屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與淀粉合成調(diào)控，OsRSR1基因的過表達(dá)使種子中的淀粉合成基因下調(diào)表達(dá)，OSRSR1的缺乏會(huì)導(dǎo)致種子中淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量增加[7]。在小麥胚乳灌漿過程中，TaRSR1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與淀粉合成酶基因TaAGPS1-a、TaAGPL1、TaGBSSI、TaSSI、TaSSIIa、TaSSIV、TaBEI、TaBEIIb、TaPUL、TaPHOL、TaDPE1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[8]。另一方面，儲(chǔ)藏于DNA堿基序列中的生物遺傳信息是通過mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯最終表達(dá)，其中基因表達(dá)量的多少對表觀性狀影響很大[9]。而且，在基因編碼區(qū)中一個(gè)堿基的變化會(huì)改變對應(yīng)蛋白的功能，植物調(diào)節(jié)基因上如發(fā)生等位變異，則可能影響整個(gè)基因在植物中的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致定量突變，而二者都是表型變異的驅(qū)動(dòng)者和種質(zhì)差異的決定因素[10]。作物品種間有性雜交后代產(chǎn)生超親變異是普遍的遺傳變異現(xiàn)象，也是選育作物新品種的重要變異來源，而且品種間有性雜交仍然是目前或?qū)磉x育新品種的主要途徑。因此，研究不同類型水稻品種及有性雜交后代轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)特點(diǎn)及基因堿基序列分析，對深入了解性狀遺傳變異的分子機(jī)理具有重要的理論意義。

本研究選用籽粒直鏈淀粉含量很高的秈稻品種和極低的糯稻品種及遺傳背景相似，但籽粒直鏈淀粉含量存在顯著差異的粳稻親本和雜交子代超親變異系等為供試材料，比較分析OsRSR1表達(dá)特點(diǎn)及序列和功能變異，旨在深入了解OsRSR1序列變異特點(diǎn)和表達(dá)特點(diǎn)及其與性狀遺傳變異關(guān)系，進(jìn)而為解析基因轉(zhuǎn)錄水平的分子調(diào)控和遺傳變異機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用胚乳直鏈淀粉含量有顯著差異的粳稻品種系選1號和通769及該品種做親本配制選育的子代超親變異系東農(nóng)1701和東農(nóng)1724以及直鏈淀粉含量極高的秈稻品種八十兒和極低的糯稻品種龍稻8號，于2016年和2017年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，盆規(guī)格為長100 cm、寬40 cm、高40 cm。為使供試材料抽穗期保持一致，于4月15日按各材料的生育期進(jìn)行分期播種，單粒等距離點(diǎn)播催芽籽，大棚缽體盤育苗，旱育秧管理。5月15-20日選長勢一致且生長良好的秧苗等距離插秧，每個(gè)品種插2盆，每盆插8穴，每穴插1棵，正常水肥管理。

供試材料抽穗時(shí)，選取長勢一致且穗部抽出葉鞘3 cm的稻穗掛牌標(biāo)記，分別于標(biāo)記后的10，20，30，40 d取樣，選取穗中部灌漿一致的30個(gè)籽粒，在低溫下去殼去胚放入凍存管中，-80 ℃超低溫保存，用于淀粉含量測定和熒光PCR定量及基因克隆。

1.2 試驗(yàn)試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和載體QBV-3由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所卜慶云研究員惠贈(zèng)。DNA Marker、克隆試劑盒購自Vazyme公司，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、EcoR V限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit質(zhì)粒提取純化試劑盒購自Transgen公司。cDNA合成試劑盒All-in One First-Strand Synthesis MasterMix(with DNase 1)、TaqSYBR?Green qPCRPreMix試劑盒、氯霉素(Cam)購自NOVA江蘇連云港愚公生物有限公司。PCR 片段回收試劑盒購自Thermo公司。其他各種生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 OsRSR1表達(dá)量測定

采用qRT-PCR方法測定籽粒OsRSR1表達(dá)量。取-80 ℃冰箱中保存的籽粒約0.2 g，用TRIzol法提取總RNA，用All-in One First-Strand Synthesis MasterMix(with DNase 1)試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。使用Premier 5.0及NCBI內(nèi)Primer Blast功能在NCBI上已公布的OsRSR1保守區(qū)設(shè)計(jì)高特異性引物及內(nèi)參基因引物(表1)。參照并優(yōu)化TaqSYBR?Green qPCR PreMix試劑盒使用說明配制特異PCR反應(yīng)體系：PreMix混合緩沖液5.0 μL、模板1.0 μL、(10 μmol/L)上下游引物各0.2 μL，加ddH2O至10 μL。三步法PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，基因拷貝數(shù)運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[11]。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，以高親系選1號抽穗后10 d表達(dá)量為1，計(jì)算其他供試材料的相對表達(dá)量。

1.4 OsRSR1克隆

采用改良冷酚抽提法提取水稻葉片的基因組DNA，依照TRIzol試劑說明書提取籽?？俁NA并純化反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的日本晴基因序列，通過Blast方法在水稻基因組Pfam數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中搜索目的基因，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，添加EcoR V酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基(表1)。參照PrimeSTAR GXL DNA Polymerase說明配制特異PCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg+Plus)緩沖液2.0 μL、dNTP mixture(2.5 mmol/L each)0.8 μL、模板1.0 μL、(10 μmol/L)上下游引物各0.4 μL、(1.25 U/μL)PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min，38個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；68 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，使用克隆試劑盒將目的片段與載體連接，采用熱激法將構(gòu)建的克隆載體QBV-3轉(zhuǎn)化到DH5α中，將搖好的菌液瞬離去上清后均勻涂布在含有氯霉素(25 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至單菌落長出。單菌落PCR鑒定正確的克隆活化搖菌，按照(EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit)試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送至上海生工公司進(jìn)行測序并進(jìn)行序列比對分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used

注：劃線處為EcoR V酶切位點(diǎn)，粗體為保護(hù)堿基。

Note：The line isEcoR V restriction sites，and the bold is protecting base.

2 結(jié)果與分析

2.1 灌漿不同時(shí)期胚乳OsRSR1表達(dá)量比較

由表2可知，6個(gè)供試材料在灌漿過程中籽粒OsRSR1表達(dá)量抽穗后10 d最大，然后迅速下降，其下降幅度龍稻8號是2.15倍，八十兒是5.40倍，其他材料是3.45～3.80倍，達(dá)到最低值后又逐漸上升，直至籽粒成熟，呈V字形變化趨勢，最低值龍稻8號是出現(xiàn)在抽穗后30 d，其他供試材料是出現(xiàn)在抽穗后20 d，說明灌漿初始階段和后期階段OsRSR1表達(dá)量大，灌漿中期表達(dá)量小。灌漿各個(gè)時(shí)期6個(gè)供試材料按OsRSR1表達(dá)量由高到低排序依次為龍稻8號、東農(nóng)1724、通769、系選1號、東農(nóng)1701和八十兒，與該材料的籽粒直鏈淀粉含量高低排序正好相反，灌漿不同時(shí)期OsRSR1表達(dá)量與籽粒直鏈淀粉含量間呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.451～-0.899，其中抽穗后20，30，40 d的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。由表2還可知，灌漿不同時(shí)期籽粒直鏈淀粉含量超高親子代東農(nóng)1701的OsRSR1表達(dá)量均顯著低于高親系選1號；籽粒直鏈淀粉含量超低親子代東農(nóng)1724的OsRSR1表達(dá)量在抽穗后30 d時(shí)顯著高于低親通769，其他時(shí)期都略高。說明OsRSR1表達(dá)量與籽粒直鏈淀粉含量間有密切關(guān)系，籽粒OsRSR1表達(dá)量高的品種其籽粒直鏈淀粉含量低，反之表達(dá)量低的品種籽粒直鏈淀粉含量高，二者間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而且品種間有性雜交子代OsRSR1表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)超親變異。

表2 不同灌漿時(shí)期胚乳OsRSR1表達(dá)量及直鏈淀粉含量比較Tab.2 Comparison of OsRSR1 expression and amylose content in endosperm at different filling stage

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。

Note：The Different lowercase letters after the same datas are significantly Different at 0.05 level.

2.2 供試材料OsRSR1克隆

在各供試材料中提取得到的總RNA的OD260/280值均約為1.95，而且各電泳條帶很清晰，無降解(圖1-A)。由圖1-B可知，基因組DNA均呈單一條帶，片段完整，與λDNA位置相同。說明本試驗(yàn)提取得到的總RNA和基因組DNA完全滿足下游試驗(yàn)的質(zhì)量要求。以該總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到第1鏈cDNA。然后分別以cDNA和DNA為模板，利用OsRSR1-1和OsRSR1-2引物進(jìn)行擴(kuò)增，在各供試材料中得到大小分別約為1 539，4 300 bp的特異預(yù)期片段(圖2)。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-6.系選1號、通769、東農(nóng)1701、東農(nóng)1724、龍稻8號、八十兒。圖2同。 M.DL 5K DNA Marker； 1-6 is Xixuan 1，Tong 769，Dongnong 1701，Dongnong 1724，Longdao 8，Bashier. The same as Fig.2.

圖2 不同供試材料PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of OsRSR1 gene for different varieties

2.3 供試材料間OsRSR1 DNA克隆序列比對

6個(gè)供試材料的OsRSR1全長基因克隆序列運(yùn)用DNAMAN與GenBank數(shù)據(jù)庫已公布的日本晴RSR1全長序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，其同源性均達(dá)99%以上，說明供試材料的OsRSR1全長序列克隆正確，可進(jìn)行后續(xù)分析。

日本晴RSR1轉(zhuǎn)錄因子基因全長序列為4 300 bp，克隆得到的6個(gè)供試材料的OsRSR1全長序列親本系選1號和通769及超親子代東農(nóng)1724為4 300 bp，超親子代東農(nóng)1701和秈稻品種八十兒為4 301 bp，糯稻品種龍稻8號為4 299 bp，說明不同材料間OsRSR1全長序列大小并不完全一致，有微小的差異。與日本晴的RSR1轉(zhuǎn)錄因子基因全長序列比較發(fā)現(xiàn)(圖3)，高親系選1號完全匹配，無SNP和In/Del變異；低親通769在第1外顯子有1個(gè)SNP；超高親子代東農(nóng)1701共有5處堿基發(fā)生變化，其中在5′端有3個(gè)In/Del，第1外顯子和第7內(nèi)含子各有1個(gè)SNP；超低親子代東農(nóng)1724共有2處堿基發(fā)生變化，第1外顯子和3′端各有1個(gè)SNP；直鏈淀粉含量極低的糯稻品種龍稻8號在5′端有1個(gè)In/Del；直鏈淀粉含量極高的秈稻品種八十兒共有16處堿基發(fā)生變化，其中在5′端有1個(gè)SNP和2個(gè)In/Del，第1外顯子有4個(gè)SNP 和1個(gè)In/Del，3′端有2個(gè)In/Del，在第3,5,6內(nèi)含子均有1個(gè)In/Del，在第6,7,8外顯子均有1個(gè)SNP。說明籽粒直鏈淀粉含量不同的水稻品種間OsRSR1全長DNA堿基序列并不完全一致，存在基因多態(tài)性，而且與親本相比有性雜交后代DNA堿基序列無論是在外顯子區(qū)還是內(nèi)含子區(qū)都可發(fā)生變化。

圖3 不同供試材料OsRSR1 DNA克隆序列比對(只顯示差異部分)Fig.3 Alignment of DNA sequences of OsRSR1 in different materials(only show the difference part)

2.4 供試材料間OsRSR1 cDNA克隆序列比對

真核生物的基因最終是由外顯子通過所編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)性狀或調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄后被剪切不表達(dá)。將圖4中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的堿基A標(biāo)記為+1，與日本晴RSR1轉(zhuǎn)錄因子基因編碼序列相比，高親系選1號在+1438位點(diǎn)處發(fā)生T→C的變化，三聯(lián)體密碼由TCC變?yōu)镃CC，絲氨酸(S)變成脯氨酸(P)；低親通769在+157位點(diǎn)處發(fā)生C→T的變化，三聯(lián)體密碼由CGC變?yōu)镃GT，脯氨酸(P)變成絲氨酸(S)。與日本晴和親本RSR1轉(zhuǎn)錄因子基因序列相比，超高親變異后代東農(nóng)1701在+160位點(diǎn)和+841位點(diǎn)處分別發(fā)生T→C和C→T的變化，三聯(lián)體密碼分別由CGT變?yōu)镃GC和CGC變?yōu)镃GT，對應(yīng)氨基酸由絲氨酸(S)變成脯氨酸(P)和沒變；超低親變異后代東農(nóng)1724在+395位點(diǎn)處發(fā)生A→G的變化，三聯(lián)體密碼由CAC變?yōu)镃GC，組氨酸(H)變成精氨酸(R)。直鏈淀粉含量極低的糯稻品種龍稻8號與日本晴和超親變異系相比，均未發(fā)生堿基和氨基酸的變化。直鏈淀粉含量極高的秈稻品種八十兒與日本晴和超親變異系相比，共有8處堿基發(fā)生變化，依次是+122位點(diǎn)T→C，三聯(lián)體密碼由ATC變?yōu)锳CC，異亮氨酸(I)變?yōu)樘K氨酸(T)；+124位點(diǎn)G→A，三聯(lián)體密碼由GCG變?yōu)锳CG，丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T)；+160位點(diǎn)T→C，三聯(lián)體密碼由TGG變?yōu)镃GG，絲氨酸(S)變?yōu)楦彼?P)；+173位點(diǎn)開始多了GCCGCC 6個(gè)堿基，多了2個(gè)丙氨酸(A)；+376位點(diǎn)C→T，三聯(lián)體密碼由CCC變?yōu)門CC，脯氨酸(P)變?yōu)榻z氨酸(S)；+1032位點(diǎn)A→C，三聯(lián)體密碼由AGA變?yōu)锳GC，精氨酸(R)變?yōu)榻z氨酸(S)；+1173位點(diǎn)C→T，三聯(lián)體密碼由GCC變?yōu)镚CT，對應(yīng)氨基酸沒變；+1 386位點(diǎn)C→G，三聯(lián)體密碼由TCC變?yōu)門CG，對應(yīng)氨基酸沒變。說明籽粒直鏈淀粉含量不同的水稻品種間mRNA堿基序列和氨基酸序列并不完全一致，存在著多態(tài)性，而且通過有性雜交產(chǎn)生的超親變異后代在基因分離和穩(wěn)定過程中某些位點(diǎn)上發(fā)生的堿基變化可形成同義或非同義的三聯(lián)體密碼。

圖4 不同供試材料OsRSR1 cDNA序列比對(只顯示差異部分)

2.5 供試材料間OsRSR1 DNA和cDNA克隆序列比較

將日本晴和6個(gè)供試材料中克隆得到的OsRSR1 DNA序列和cDNA序列的堿基變化及變化位點(diǎn)比較結(jié)果列于表3。

由表3可知，在供試材料中克隆得到的DNA序列和cDNA序列在編碼區(qū)發(fā)生的堿基變化位點(diǎn)共有7處相同和6處不同。其中堿基變化位點(diǎn)相同的在第1外顯子有4處，分別對應(yīng)DNA和cDNA位點(diǎn)的686-122、688-124、737-173、940-376；在第6,7,8外顯子各有一處，分別對應(yīng)DNA和cDNA位點(diǎn)的2 317-1 032、2 852-1 173和3 815-1 386。堿基變化位點(diǎn)不同的又分為只在DNA克隆序列上發(fā)生變化和只在cDNA克隆序列上發(fā)生變化2種，其中變化只發(fā)生在DNA克隆序列上的位點(diǎn)為724，只發(fā)生在cDNA克隆序列上的變化位點(diǎn)在第1外顯子有3處，分別對應(yīng)cDNA位點(diǎn)的157、160和395；在第3和第8外顯子分別有一處，分別對應(yīng)cDNA位點(diǎn)的841和1 438。

超親變異材料中的超高親子代東農(nóng)1701與親本相比，發(fā)生堿基變化的位點(diǎn)既有同時(shí)發(fā)生在DNA和cDNA克隆序列上的如686-122，也有只在DNA克隆序列堿基位點(diǎn)724和只在cDNA克隆序列堿基位點(diǎn)160發(fā)生的變化；超低親子代東農(nóng)1724只分別在DNA克隆序列堿基位點(diǎn)724和cDNA克隆序列堿基位點(diǎn)395發(fā)生堿基變化。說明在DNA序列上發(fā)生變異的堿基正常轉(zhuǎn)錄成mRNA序列，形成與DNA序列匹配的mRNA堿基序列，而且在轉(zhuǎn)錄過程中也發(fā)生個(gè)別堿基的變化，形成與DNA堿基序列不配的mRNA堿基序列，最終形成同義或非同義的三聯(lián)體密碼，是性狀產(chǎn)生遺傳變異和基因多態(tài)性的重要途徑。

表3 不同供試材料OsRSR1 DNA和cDNA堿基變化比較Tab.3 Comparison of DNA and cDNA sequences of OsRSR1 in different materials

注：同列*表示沒有對應(yīng)位點(diǎn)；同行×表示該位點(diǎn)沒有堿基；下劃線表示堿基發(fā)生變化。

Note：In the same column，*means there is no corresponding locus；In the same column，×means there is no base；The underscore indicates a change in the base.

2.6 供試材料間OsRSR1結(jié)構(gòu)比較

在NCBI的ORF Finder在線分析網(wǎng)站上分析6個(gè)供試材料OsRSR1克隆序列結(jié)果如圖5所示。八十兒的OsRSR1含一個(gè)長1 545 bp的ORF(Open reading frame，開放閱讀框)，編碼514個(gè)氨基酸；其他5個(gè)供試材料含一個(gè)長1 539 bp的ORF，編碼512個(gè)氨基酸。

利用Protfun(http：//www.cbs.dtu.dk/Services/ProtFun/)軟件對OsRSR1蛋白功能進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明，OsRSR1蛋白有14種功能，其中轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的預(yù)測值和概率均最高(表4)，說明該基因的主要功能是調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5 OsRSR1基因編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.5 Putative protein structure domains of amino acid sequence encoded by RSR1 gene in rice

功能分類 Functional category預(yù)測值 Probability概率 Odds信號轉(zhuǎn)導(dǎo) Signal transducer0.0740.346受體 Receptor0.0030.020激素 Hormone0.0010.206結(jié)構(gòu)蛋白 Structural protein0.0020.064運(yùn)載體 Transporter0.0250.228離子通道 Ion channel0.0100.181電壓門控離子通道 Voltage gated ion channel0.0040.178陽離子通道 Cation channel0.0100.215轉(zhuǎn)錄 Transcription0.2091.631轉(zhuǎn)錄調(diào)控 Transcription regulation0.2081.665脅迫應(yīng)答 Stress response0.0100.119免疫應(yīng)答 Immune response0.0120.137生長因子 Growth factor0.0412.910金屬離子轉(zhuǎn)移Metal ion transport0.0090.020

采用SMAET數(shù)據(jù)庫對OsRSR1基因編碼氨基酸序列的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析結(jié)果表明，水稻OsRSR1由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，與PhotoZome中日本晴RSR1基因結(jié)構(gòu)相同，說明該基因序列的堿基變化均未改變基因的完整結(jié)構(gòu)。OsRSR1蛋白結(jié)構(gòu)中包含完整的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于171-233和263-326位點(diǎn)間高度保守的AP2/EREBP Domain元件，是由大約57-70個(gè)氨基酸殘基組成，與謝永麗[12]報(bào)道的AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因家族的AP2亞族相一致。該結(jié)構(gòu)域N-端具有堿性和親水性的YRG是由約20個(gè)氨基酸殘基組成的一段高度保守序列，具有3個(gè)反向平行的β-折疊，對識別各類順式作用元件并與之相互結(jié)合起關(guān)鍵作用；C-端約含有40個(gè)氨基酸殘基的RAYD調(diào)節(jié)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合；在C-端還具有L/FDLNL/F(X)P類型的EAR模體，在轉(zhuǎn)錄因子某些調(diào)控途徑中發(fā)揮抑制作用(圖6)。通過比較分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，6個(gè)供試材料的個(gè)別氨基酸變異均未發(fā)生在AP2 Domain和EAR模體區(qū)域內(nèi)，說明籽粒直鏈淀粉含量差異顯著的6個(gè)供試材料間的氨基酸差異并沒導(dǎo)致OsRSR1蛋白的基本元件和功能變化，該蛋白結(jié)構(gòu)域保守性很強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子基因與性狀遺傳變異

水稻胚乳淀粉合成調(diào)節(jié)因子OsRSR1(RiceStarchRegulator1)是AP2/EREBP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)調(diào)控淀粉合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[13]，在水稻種子發(fā)育中起著必不可少的作用[14-16]。在rsr基因突變體中胚乳淀粉合成基因表達(dá)量均被上調(diào)，種子中直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉顯微結(jié)構(gòu)改變，形成松散的圓形淀粉顆粒，最終導(dǎo)致淀粉糊化溫度降低[13]。在小麥籽粒灌漿過程中TaRSR1基因的表達(dá)量與淀粉合成酶基因中第2組基因(TaAGPS1-a、TaAGPL1、TaGBSSI、TaSSI、TaSSIIa、TaSSIV、TaBEI、TaBEIIb、TaPUL、TaPHOL和TaDPE1)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[8]。劉海英等[17]通過RNAi技術(shù)干擾RSR1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果表明，OsRSR1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的RSR1基因mRNA表達(dá)量顯著下降，而籽粒OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPS2、OsGBSSI、OsSSSI、OsSSSIV-2和OsSBE3等淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量和胚乳直鏈淀粉含量均極顯著增加，RSR1基因的表達(dá)量與胚乳淀粉合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和直鏈淀粉含量間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在灌漿過程中籽粒OsRSR1表達(dá)量呈V字形變化趨勢，灌漿初始階段和后期階段表達(dá)量大，灌漿中期表達(dá)量小，與灌漿中期表達(dá)量最大，且呈單峰曲線變化趨勢的OsSBE1、OsSBE3、OsSSSⅠ、OsSSSⅡ-1、OsSSSⅡ-3、OsSSSⅢ-1、OsSSSⅢ-2、ISA1、ISA3等淀粉合成關(guān)鍵酶基因正好相反[18-20]，而且灌漿不同時(shí)期OsRSR1表達(dá)量與籽粒直鏈淀粉含量間呈顯著負(fù)相關(guān)，且籽粒直鏈淀粉含量超高親子代和超低親子代的OsRSR1表達(dá)量在灌漿各時(shí)期均低于高親或高于低親，即該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量出現(xiàn)與籽粒直鏈淀粉含量同樣的超親變異現(xiàn)象。說明OsRSR1的表達(dá)量和胚乳淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量及直鏈淀粉含量間是同步變化關(guān)系。mRNA序列上的堿基變異能引起由該基因編碼合成的蛋白質(zhì)氨基酸序列的變化，以致蛋白質(zhì)功能的變化，進(jìn)而導(dǎo)致最終產(chǎn)物的合成與積累或表觀性狀的遺傳變異[18]。因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化是基因最終表觀性狀變異的重要前提。由本試驗(yàn)對OsRSR1全長DNA和cDNA序列比較分析結(jié)果可知，雖然供試的6個(gè)材料間或子代與親本間比較都發(fā)生了個(gè)別堿基和氨基酸的變化，但由OsRSR1蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果卻可知，6個(gè)供試材料的氨基酸變異均未發(fā)生在AP2 Domain和EAR模體區(qū)域內(nèi)，籽粒直鏈淀粉含量差異顯著的6個(gè)供試材料間的氨基酸差異并沒導(dǎo)致OsRSR1蛋白的基本元件和功能變化，表明供試材料間籽粒直鏈淀粉含量的顯著差異可能與已發(fā)生的個(gè)別氨基酸變異沒關(guān)系。淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量和酶活性及直鏈淀粉含量變化是同步變化關(guān)系，即轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的增加提高了酶活性和直鏈淀粉含量[18-20]。在本試驗(yàn)中，OsRSR1表達(dá)量變異引起的下游淀粉合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變異及酶活性變化是供試材料間籽粒直鏈淀粉含量存在差異甚至產(chǎn)生超親變異的主要內(nèi)在因素。因此，轉(zhuǎn)錄因子基因通過自身轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的變化調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，進(jìn)而激活或抑制與結(jié)構(gòu)基因關(guān)聯(lián)的酶活性，是品種間有性雜交子代表觀性狀發(fā)生遺傳變異或超親遺傳變異內(nèi)在調(diào)控機(jī)制之一。

圖6 不同供試材料OsRSR1氨基酸序列比對Fig.6 Alignment of amino acids sequences of OsRSR1 in different materials

3.2 關(guān)于遺傳密碼變異途徑

生物的遺傳信息儲(chǔ)存在基因的DNA堿基序列中，不同的堿基序列編碼合成相同或不同的氨基酸序列，進(jìn)而形成功能各異的結(jié)構(gòu)蛋白或功能蛋白，最終表達(dá)該基因的遺傳信息。因此，基因堿基序列的變異是生物產(chǎn)生遺傳變異和基因多態(tài)性的內(nèi)在因素，深入分析基因堿基序列的變異機(jī)理對闡明生物遺傳變異的內(nèi)在機(jī)制具有重要意義。從本試驗(yàn)籽粒直鏈淀粉含量差異極顯著的供試材料間OsRSR1全長DNA和cDNA序列比較可知，不同品種間OsRSR1堿基序列無論是在數(shù)量上還是在質(zhì)量上都有微小或大的差異，導(dǎo)致該基因具有豐富的多態(tài)性。以DNA為模板按照堿基配對的方式轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，進(jìn)而翻譯成氨基酸序列是遺傳信息的正常表達(dá)過程。因此，DNA堿基序列的變異導(dǎo)致mRNA序列和氨基酸序列變異是很正常的遺傳變異發(fā)生過程。

已有研究表明，SNPs、In/Del和結(jié)構(gòu)上的變化是大多數(shù)生物基因組中最多的變異[21]，且堿基片段的插入或缺失在內(nèi)含子區(qū)域時(shí)與表型特征變異密切相關(guān)[22]。江蘇水稻巨胚種質(zhì)基因的克隆發(fā)現(xiàn)，GE基因堿基序列有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，第1 090位點(diǎn)由C→G；第1 302位點(diǎn)由T→G；第1 467位點(diǎn)由G→A，并提前形成終止密碼子TGA；10 217個(gè)巨胚基因中g(shù)e基因是新的GE等位基因，表明基因在個(gè)別位點(diǎn)上堿基的變化導(dǎo)致基因功能的變化，最終表現(xiàn)性狀的遺傳變異[23]。Sun等[24]通過克隆豌豆2258葉綠體GS2的cDNA，得出ORF為1 293 bp，推測其氨基酸為431 bp，將其與Tingey公布的豌豆葉綠體GS2的cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者有4個(gè)堿基發(fā)生變化，分別位于4個(gè)三聯(lián)體密碼中，卻只有1處對應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，其他均為同義突變。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，直連淀粉含量差異顯著的6個(gè)供試材料間OsRSR1全長DNA序列和cDNA序列同源性高達(dá)99%以上，氨基酸序列保守性也很強(qiáng)，但仍有個(gè)別位點(diǎn)發(fā)生堿基和氨基酸序列的變化。其中全長DNA克隆序列中，5′非編碼區(qū)、外顯子、內(nèi)含子和3′非編碼區(qū)均有個(gè)別堿基的變化，cDNA克隆序列也同樣發(fā)生個(gè)別堿基的變化，但兩者間變化的位點(diǎn)和堿基既有相同的位點(diǎn)，也有不同的位點(diǎn)，并最終形成的三聯(lián)體密碼和氨基酸也有相同的密碼和氨基酸，也有不同的密碼和氨基酸，表明基因組的DNA堿基序列轉(zhuǎn)錄成mRNA過程中也產(chǎn)生堿基的變異。然而，堿基的這種變異難以從DNA堿基序列預(yù)測，具有偶然性，是生物產(chǎn)生遺傳變異的另一種重要內(nèi)在機(jī)制。由于mRNA序列上的一個(gè)堿基變化也能引起蛋白質(zhì)的功能變化，因此，深入分析其產(chǎn)生這種變異的機(jī)制對闡明性狀變異的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。