蘇 蕊，楊 鐘，麗 春，李曉凱，馬宇浩，李金泉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 3.呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

內(nèi)蒙古絨山羊是我國優(yōu)秀絨山羊品種，所產(chǎn)羊絨潔白、柔軟、纖細(xì)、光澤好，是一類高檔的紡織原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。內(nèi)蒙古絨山羊包括3個(gè)不同類群：阿拉善型、阿爾巴斯型及二狼山型，其中，以阿拉善型所產(chǎn)羊絨品質(zhì)最佳，其細(xì)度和色澤上乘，享譽(yù)國內(nèi)外[2]。線粒體是真核細(xì)胞的一種細(xì)胞器，擁有其自己的基因組，也能編碼細(xì)胞器的一些蛋白質(zhì)[3]。通常，除少數(shù)低等真核生物的線粒體基因組是線狀DNA分子外，其他生物的線粒體基因組DNA均為閉合環(huán)狀分子。由于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)擁有許多線粒體，而且一個(gè)線粒體里也有多份基因組拷貝，所以，一個(gè)細(xì)胞里也就包含多個(gè)線粒體基因組。線粒體 DNA (mtDNA)是一種核外遺傳物質(zhì)，與核 DNA 相比，具有分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性及提取方便等特點(diǎn)。由于這些特點(diǎn)，使得線粒體基因組成為研究動物起源進(jìn)化及群體遺傳分化的理想對象及研究真核生物分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子系統(tǒng)進(jìn)化的重要模式體系[4]。就目前來說，線粒體基因組的測定方法主要包括：基于Sanger 測序法的經(jīng)典線粒體基因組測序；基于PCR方法的線粒體基因組測序；基于靶序列雜交和體外擴(kuò)增的滾環(huán)擴(kuò)增測序以及基于二代高通量測序技術(shù)(NGS)的線粒體基因組測序方法[5-7]。近年來，關(guān)于內(nèi)蒙古絨山羊的研究大多集中于核基因組及其核基因組中功能基因表達(dá)調(diào)控[8]，而有關(guān)線粒體基因組的研究鮮有報(bào)道。

本研究基于NGS方法分析內(nèi)蒙古絨山羊線粒體基因組結(jié)構(gòu)和序列，同時(shí)對不同絨山羊品種個(gè)體之間線粒體DNA序列進(jìn)行比較分析，旨在通過對內(nèi)蒙古絨山羊線粒體基因組序列的測定和分析，豐富和擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫，為不同物種間線粒體基因組的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)、進(jìn)化等分析提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

選取內(nèi)蒙古絨山羊(阿拉善型)成年母羊，使用經(jīng)滅菌處理過的耳缺鉗采集黃豆粒大小耳組織樣品，置于2 mL含有75%乙醇的無菌Eppendorf管中帶回實(shí)驗(yàn)室，組織樣品可短期保存于-20 ℃冰箱，用于基因組DNA的提取。

1.2 基因組DNA的提取

按照常規(guī)“酚-氯仿”法進(jìn)行操作和提取[9]，通過NanoDrop2000和瓊脂糖凝膠電泳并對所提取的絨山羊基因組DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.3 小插入片段文庫制備

基因組DNA經(jīng)純化后，利用Covaris進(jìn)行基因組DNA片段化，構(gòu)建基因組測序文庫，將打斷后的小片段基因組分別與接頭A、B引物連接，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，僅篩選DNA片段一側(cè)為接頭A、另一側(cè)為接頭B的基因組片段，雙鏈變性，得到分離的DNA片段，用于下一步橋式PCR。

1.4 橋式PCR

引物特異性識別互補(bǔ)配對結(jié)合于DNA一端，然后結(jié)合于芯片上；沒有被引物結(jié)合的另一端，與旁邊的其他引物序列互補(bǔ)識別，同樣結(jié)合上來，形成一個(gè)“橋”，通過PCR擴(kuò)增得到DNA簇，DNA擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過線性化形成單鏈DNA分子，用于下一步高通量測序。

1.5 Illumina PE測序

將dNTP用4種不同的熒光進(jìn)行標(biāo)記，加入修飾后的聚合酶，每個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，只在體系中添加一種含有熒光標(biāo)記的堿基；通過激光掃描芯片，分別讀取每一輪反應(yīng)過去互補(bǔ)結(jié)合上去的核苷酸序列；通過化學(xué)法，對“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”進(jìn)行切割，使得3′末端黏性得以恢復(fù)，開啟下一輪的核苷酸聚合過程；對每一輪反應(yīng)得到的熒光信號進(jìn)行收集轉(zhuǎn)化，可轉(zhuǎn)化為模板DNA的序列。

1.6 基因組序列組裝

原始數(shù)據(jù)比對參考基因組，篩選滿足條件的reads，進(jìn)行基因組組裝和預(yù)測。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

登陸NCBI官網(wǎng)，進(jìn)入BLAST網(wǎng)頁(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，依次選擇Web BLAST→Nucleatide BLAST→blastn的分析模塊。下載用于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析的其他品種的山羊線粒體基因組序列信息，存儲為文本文件。在Enter Query Sequence下的選擇上傳ARS1的參考線粒體序列，同時(shí)勾選：“Align two or more sequences”選項(xiàng)。在Enter Subject Sequence步驟中上傳本研究的山羊線粒體基因組，在“Algorithm parameters”選項(xiàng)中的“Filters and Masking”，選擇“Specifics-specific repeats for Capra hircus (Goat)”，然后進(jìn)行Blast分析。在生成的結(jié)果中查看相關(guān)分析內(nèi)容，選擇“Distance tree of results”點(diǎn)擊，查看構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果。根據(jù)分析方法的不同，本研究選擇Neighbor Joining方法構(gòu)建絨山羊的系統(tǒng)發(fā)育樹，并把結(jié)果以Newich file格式保存在本地。隨后利用MEGA軟件包對此系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行修剪調(diào)整。

1.8 線粒體基因組堿基組成成分分析

利用MEGA軟件中的序列分析軟件包對不同線粒體的堿基組成進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠，對基因組DNA提取的結(jié)果進(jìn)行了電泳檢測，結(jié)果顯示，所提取基因組DNA為一條較致密、清晰、整齊的條帶，并且沒有拖尾，說明DNA完整性較好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。Nano drop檢測結(jié)果如表1所示。

表1 DNA檢測結(jié)果Tab.1 The quality of total DNA

2.2 高通量測序結(jié)果

2.2.1 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果 高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling軟件，轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ格式的文件進(jìn)行儲存。對測序reads的每個(gè)circle進(jìn)行堿基分布和質(zhì)量波動的統(tǒng)計(jì)，可以直觀地反映出測序樣本的測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量(圖1)。在基因組測序的文庫構(gòu)建中，當(dāng)建庫質(zhì)量較為理想時(shí)，代表不同堿基的不同灰度的界線通常波動極小，基本在一條水平線上。從結(jié)果可知，本試驗(yàn)所構(gòu)建的基因組測序文庫堿基分布均一性良好，可用于后續(xù)分析。

圖1 堿基分布Fig.1 The distribution of bases

2.2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 比對參考基因組前后的數(shù)據(jù)分別對測序reads數(shù)、總堿基數(shù)、Q20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明(表2)，測序共得到2 551 175 100 bp冗余數(shù)據(jù)，過濾后得到Clean data為1 553 400 bp，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為95.40%。由于線粒體DNA測序?yàn)殡p末端測序，所以，實(shí)際片段數(shù)分別為原始測序片段數(shù)與過濾后片段數(shù)的2倍。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Sequencing data

2.2.3 基因組組裝結(jié)果 采用線粒體專業(yè)組裝軟件mitoMaker http://sourceforge.net/projects/mitomaker/對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，組裝采用默認(rèn)參數(shù)，組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，組裝后的線粒體基因組長度為16 642 bp的閉合環(huán)狀DNA(圖2)，其基因組GC含量為39.17%，K-mer大小為53 bp。

表3 線粒體基因組組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 The statistical results of mitochondrial genome assembly

圖2 內(nèi)蒙古絨山羊(阿拉善型)線粒體基因組組裝Fig.2 mtDNA of Inner Mongolia Cashmere goat(Alashan type)

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果 由圖3可知，內(nèi)蒙古絨山羊的3個(gè)類群距離相對比較近，其中，阿拉善型和二狼山型的關(guān)系最近，阿爾巴斯型次之；內(nèi)蒙古絨山羊和遼寧絨山羊可以分為單獨(dú)的2個(gè)類群；與國外品種San Clemente的距離最遠(yuǎn)。該結(jié)果與我國絨山羊選育的歷程基本一致。

圖3 不同品種山羊線粒體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果Fig.3 The results of phylogenetic of different goat mtDNA genome

2.2.5 堿基成分分析結(jié)果 利用MEGA軟件中的序列分析軟件包對不同線粒體的堿基組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示，不同品種絨山羊，其線粒體基因組的堿基成分含量基本一致，這表明線粒體基因組在絨山羊的進(jìn)化過程中比較保守，具有較強(qiáng)的種屬特異性。

表4 線粒體基因堿基組成Tab.4 The base composition of different mitochondrial genome %

3 討論與結(jié)論

本研究中高通量測序采用的是Illumina PE測序平臺，可以實(shí)現(xiàn)覆蓋基因組100×深度的高通量測序，根據(jù)序列組裝結(jié)果，可以獲取較為準(zhǔn)確的基因組序列信息。該測序方法測序深度高，數(shù)據(jù)量大，可靠性強(qiáng)[10-11]。由于mi-seq采用雙末端測序，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，使用FASTX軟件去掉序列末尾質(zhì)量低于Q15的堿基并使用FLASH軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行合并[12-13]；在測序試驗(yàn)的過程中得到的產(chǎn)物，有時(shí)候會包含有一些非特異性的擴(kuò)增片段，通過特異性引物信息可以將其去掉[14-15]。本研究中，在分析的時(shí)候，將標(biāo)簽序列去除，并對處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)及長度分布統(tǒng)計(jì)。

同其他家畜品種不同，關(guān)于羊的線粒體基因組及線粒體DNA的研究較為有限，不如牛、豬等其他家畜研究深入[16-17]，然而也取得了一些研究成果，但大多集中在線粒體DNA及其多態(tài)性方面。例如，對來自我國18個(gè)不同地方山羊品種的線粒體DNA進(jìn)行了多態(tài)性研究，結(jié)果表明，我國地方山羊品種可能起源于2個(gè)不同的母系祖先[18]。葉紹輝等[19]通過限制性酶切方法對云南當(dāng)?shù)厣窖蚝统r的土種山羊進(jìn)行了檢測和分析，結(jié)果表明，亞洲山羊很可能是源于相同的祖先。賈永紅等[20]也通過對線粒體DNA多態(tài)性的檢測，對貴州不同山羊品種進(jìn)行了檢測和分析，結(jié)果表明，貴州山羊可能存在2個(gè)不同的母系祖先，分化的年代大約在19 萬年前。在綿羊相關(guān)的研究中，霍俊宏[21]對我國6個(gè)不同的地方綿羊品種的線粒體 DNA 的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在這些綿羊群體中確實(shí)存在 “C”單倍型，表明它們可能共有3個(gè)母系起源。通過對線粒體基因組及線粒體DNA進(jìn)行研究，將對研究羊的起源和進(jìn)化有幫助[22]。

內(nèi)蒙古絨山羊的3個(gè)不同類型是在內(nèi)蒙古自治區(qū)獨(dú)特的自然選擇和人工選擇的條件下形成的獨(dú)特品種，其中內(nèi)蒙古絨山羊(阿拉善型)所產(chǎn)的山羊絨是我國絨山羊品種中質(zhì)量最好的絨毛之一[23-24]。開展內(nèi)蒙古絨山羊線粒體基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究，對于深入了解內(nèi)蒙古絨山羊生長發(fā)育過程中重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因表達(dá)與調(diào)控的遺傳機(jī)制、核外基因與核內(nèi)遺傳信息的互作、絨山羊重要生理功能及其有關(guān)母性遺傳的遺傳關(guān)系具有重要的作用。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，為絨山羊的起源、進(jìn)化、不同類群的分化以及特定遺傳特性的形成機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。另外，內(nèi)蒙古絨山羊線粒體基因組序列的測定和分析可以豐富和擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫，為不同物種間線粒體基因組的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)、進(jìn)化等分析提供依據(jù)。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為研究絨山羊起源進(jìn)化和特定遺傳特性的形成機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。