索藝寧，張春可，于喬喬，張恩源，謝冬微，冷 月，王 亮，孫 健

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)濟作物研究所， 黑龍江 哈爾濱 150086；3.昆明市煙草公司，云南省煙草公司昆明市公司，云南 昆明 650051)

水稻是世界上重要的糧食作物之一[1]，是我國主要的糧食作物[2]。水稻栽培區(qū)的土壤鹽堿化日趨嚴重。在鹽堿稻作區(qū)的水稻在苗期時對鹽堿危害更為敏感，故而，提高水稻在苗期時的耐鹽性及耐堿性對鹽堿稻作區(qū)的作用重大。近年來，水稻耐鹽QTL研究取得了較大進展，大量與耐鹽性狀有關的QTL相繼被報道，但對于根系相關性狀的研究相對較少，而水稻根系對于水稻整個生育期的生長發(fā)育有著十分重要的作用[3]。大多數(shù)研究利用群體作圖進行遺傳連鎖圖譜的繪制，與群體耐鹽堿性鑒定的結果相結合，對耐鹽堿相關基因進行初步定位。以便有效地利用種質(zhì)資源，挖掘與水稻耐鹽堿相關的優(yōu)質(zhì)基因，為水稻耐鹽相關基因及耐堿相關基因的精確定位以及分子標記輔助育種提供理論依據(jù)。根系既能固定植株還能吸收水分和養(yǎng)分，并且還是水稻合成內(nèi)源激素的主要器官，是水稻重要的組織器官[4-5]。并且，根系還是水稻地上部分與地下部分的物質(zhì)交換與信息交流的系統(tǒng)之一[6]，在鹽堿脅迫下水稻苗期根數(shù)和根長能較直觀地反映出水稻耐鹽堿的強度[7]。顧興友等[8]利用RLFP標記以Pokkali及Peta雜交構建的回交群體鑒定了與水稻苗期鮮干質(zhì)量比、Na+含量以及鹽害級別相關的5個QTL。Lee等[9]利用群體定位到與水稻苗期耐鹽相關的2個QTL。林鴻宣等[10]利用RIL群體定位到4個與秧苗存活天數(shù)相關的QTL。Kim等[11]以回交導入系群體為材料定位到8個與鹽脅迫條件下苗高、葉片面積及鮮質(zhì)量相關的QTL。楊靜等[12]以Lemont和特清的雙向導入系為作圖群體定位到了18個與苗期耐鹽相關性狀有關的QTL。許多研究已經(jīng)證明，水稻的耐鹽性基因和耐堿性基因具有遺傳多樣性，并利用不同的群體或不同的品種對水稻耐鹽性及水稻的耐堿性相關的性狀進行QTL定位，然而目前研究鹽、堿條件下產(chǎn)量性狀的QTL較多，在苗期根系相關性狀研究卻鮮有報道，水稻的根系在水稻的生育過程中起重要作用。因此，在鹽和堿脅迫條件下研究水稻苗期根系表型性狀有重要意義。

本試驗以東農(nóng)425和長白10號衍生的重組自交系群體為遺傳研究材料，對水稻苗期時的根數(shù)和根長在鹽脅迫和堿脅迫條件下進行QTL分析，深入挖掘水稻耐鹽堿性的QTL，為水稻耐鹽堿性相關基因的QTL精細定位和水稻耐堿品種的選育提供理論和科學支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗以優(yōu)質(zhì)粳稻品種東農(nóng)425(DN425)為母本，以耐鹽、耐堿性強的粳稻品種長白10號(CB10)為父本配置雜交組合，經(jīng)過多次自交，通過單粒傳獲得的F7群體作為試驗材料。

1.2 水稻苗期耐鹽堿性鑒定

本試驗在東北農(nóng)業(yè)大學國家水稻區(qū)域技術創(chuàng)新中心的溫室進行，共設3種處理：自然條件、鹽脅迫條件和堿脅迫條件。首先將處理材料進行預處理，打破休眠：選取50粒籽粒飽滿的種子在50 ℃的條件下烘干3 d；表面消毒：使用0.5%的NaClO處理10 min進行表面消毒；浸種：用清水沖洗干凈后，在28 ℃的條件下浸種2 d。然后在塑料秧盤內(nèi)選取每個家系和親本種子的20粒露白發(fā)芽一致的種子進行播種，放置在20 L盛有水的塑料盆內(nèi)，使用pH值在5.5左右的清水培養(yǎng)至三葉一心期。鹽脅迫時將清水換成含50 mmol/L NaCl的Yoshida 營養(yǎng)液[13]預處理3 d后，再將NaCl溶液的濃度增至140 mmol/L，營養(yǎng)液的pH值維持在5.5左右。堿脅迫時將清水換成0.05% Na2CO3的Yoshida營養(yǎng)液預處理3 d后，再將Na2CO3溶液的濃度增至0.15%，使溶液的pH值維持在8.5左右，每5 d換一次營養(yǎng)液[14]。在處理12 d后，收獲根部，測出群體及親本的根數(shù)及根長。

在自然條件、鹽脅迫和堿脅迫3個環(huán)境：E1(2015年對照)、E2(2015 年鹽處理)、E3(2015年堿處理)，每株系隨機選取非邊株的5個單株。測得DN425和CB10及F7群體的2項根系性狀：根數(shù)(Root number，RN)、根長(Root length，RL)，以3次重復的平均值作為統(tǒng)計單元。

1.3 根系相關性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2016對根系的根數(shù)和根長數(shù)據(jù)進行處理，再用SPSS(Version 17.0 for Windows)對根數(shù)和根長進行統(tǒng)計及相關性檢驗分析。

1.4 構建遺傳連鎖圖譜并定位QTL

本試驗葉片的DNA使用由天根生化科技(北京)有限公司提供的DNA提取試劑盒提取?；诒驹囼炓褭z測到的多態(tài)性SSR標記102對，具有多態(tài)性的Indel引物113對，用于構建連鎖圖譜；由華大基因合成SSR引物，由新?；蚝铣蒊ndel引物。利用兩親本間具有多態(tài)性的215對引物對F7的180個單株DNA進行PCR擴增，PCR反應和電泳方法參考邢軍等[14]方案，利用Mapchart 2.2軟件繪制遺傳連鎖圖譜。取2015年耐鹽堿性根長和根數(shù)數(shù)據(jù)的平均值進行分析。利用QTL IciMapping v3.3軟件的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進行加性QTL定位，設定LOD值為2.0[15]。QTL命名參照McCouch等[16]的方法。

2 結果與分析

2.1 鹽、堿脅迫條件下水稻苗期根系性狀的表型值分析

2.1.1 水稻耐鹽根數(shù)和根長的表型分析 在鹽脅迫、堿脅迫和自然條件下親本及RIL群體單株根數(shù)和根長的表型分析(表1)。在自然條件下母本DN425和父本CB10的根數(shù)和根長存在極顯著差異(P<0.01)，且根數(shù)DN425高于CB10，根長CB10高于DN425。鹽脅迫條件下根數(shù)、根長在兩親本之間表現(xiàn)出極顯著差異，且根數(shù)DN425高于CB10，根長CB10高于 DN425。自然條件與鹽脅迫的差值下，根數(shù)、根長在兩親本之間表現(xiàn)出極顯著差異，且根數(shù)、根長DN425 高于CB10。DN425與CB10間根數(shù)和根長的遺傳差異大，在耐鹽性方面有明顯差別，為QTL分析提供了良好的遺傳背景。

表1 水稻苗期親本及重組RIL群體在不同環(huán)境下根系的表型分析Tab.1 Phenotypic analysis of different environments root for RIL population and parents at the seedling stage in rice

注：不同大寫字母表示在0.01 水平上顯著相關。

Note：Different capital letter indicate significance at the level of 1%.

2.1.2 水稻耐堿根數(shù)和根長的表型分析 堿脅迫條件下根數(shù)、根長在兩親本之間表現(xiàn)出極顯著差異，且根數(shù)、根長CB10高于DN425。自然條件與堿脅迫的差值下，根數(shù)、根長在兩親本之間表現(xiàn)出極顯著差異，且根數(shù)、根長DN425高于CB10。DN425與CB10在根數(shù)和根長間的遺傳差異大，在耐堿性方面有明顯差別，為之后的QTL分析提供良好的遺傳背景。

在鹽脅迫條件和堿脅迫條件下，DN425、CB10以及RIL群體的的根數(shù)和根長都受到明顯影響，其中在堿脅迫條件下水稻更為敏感，苗期根系的根數(shù)和根長降低更明顯。其中CB10顯示出了較強的耐鹽性以及耐堿性，其根數(shù)和根長的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于DN425。在鹽脅迫和堿脅迫條件下，水稻DN425的根數(shù)和根長在自然條件與堿脅迫條件下差值的平均值高于在自然條件與鹽脅迫條件下差值的平均值，由此可知，DN425對堿脅迫條件比CB10更為敏感，即在堿脅迫的條件下DN425的根數(shù)和根長受到了更大程度的限制。除了鹽脅迫下的根數(shù)以外，RIL群體根數(shù)和根長在其他條件下都處在DN425與CB10間，并且根數(shù)和根長的變異范圍廣，具有很明顯的超親分離現(xiàn)象，峰度、偏斜度的絕對值基本上都小于或接近1.0。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布的適合性檢驗，表明根數(shù)和根長基本都符合正態(tài)分布，與數(shù)量性狀的遺傳特性相符合(圖 1)。

圖1 鹽脅迫和堿脅迫下水稻根數(shù)根長的分布Fig.1 Distribution of root number and root length under salt stress and alkaline stress in rice

2.2 水稻鹽脅迫和堿脅迫條件下根數(shù)、根長的相關分析

通過對水稻鹽、堿脅迫和自然條件下根數(shù)和根長的相關性分析可知(表 2)，在自然條件下，根數(shù)與根長呈極顯著正相關；在鹽脅迫條件下，根數(shù)與根長呈極顯著正相關；在堿脅迫條件下，根數(shù)與根長呈極顯著正相關。

表 2 性狀間的相關系數(shù)Tab.2 Correlation coefficients among traits

注：*和**分別表示在 0.05 和 0.01 水平上顯著相關。

Note：*and**indicate significance at the level of 5% and 1% .

2.3 水稻鹽、堿脅迫條件下根數(shù)和根長相關性狀的QTL分析

使用QTL IciMapping v3.3完備區(qū)間作圖法(ICIM)對水稻的耐鹽性和耐堿性的根數(shù)和根長進行加性QTL的定位分析，結果見表3。在自然條件、鹽脅迫條件、堿脅迫條件下檢測到了18個具有加性效應的QTL，分別分布在第1，2，3，4，5，7，8，9，10號染色體上，LOD值為2.01～3.35，表型變異的貢獻率為6.02%～20.06%。

在自然條件下，檢測到4個與根數(shù)相關的QTL，分布在第4，7，10染色體上，分別位于第4號染色體的Indel31～Indel38區(qū)間內(nèi)，第7號染色體的RM182～RM346、Indel61～Indel65區(qū)間內(nèi)，第10號染色體的RM474～Indel89區(qū)間內(nèi)，其中，qNRN7-2貢獻率最大，為12.46%。qNRN10的增效基因來自CB10，其余的qNRN4、qNRN7-1、qNRN7-2的增效基因皆來自于DN425，且未檢測到與根長相關的QTL。

在鹽脅迫條件下，檢測到5個與根數(shù)、根長相關QTL，分別分布在第1，3，5，7和9號染色體上。其中，共檢測到4個與根數(shù)相關的QTL，分別位于1號染色體的RM529～Indel1區(qū)間內(nèi)、3號染色體的RM1324～RM517區(qū)間內(nèi)、7號染色體的RM560～RM182區(qū)間內(nèi)和9號染色體的Indel77～RM215區(qū)間內(nèi)，其中，qSRN3貢獻率最大，為20.06%，qSRN3和qSRL5的增效等位基因皆來自于CB10；qSRN1、qSRN7、qSRN9 的增效等位基因均來自于DN425。

在堿脅迫條件下，共檢測到3個與根數(shù)和根長相關的QTL，分別分布在第2，3，5 染色體上，其中，位于第2號染色體的Indel20～RM207區(qū)間內(nèi)qARN2為與根數(shù)相關的QTL，貢獻率為12.99%，其增效等位基因來自 CB10，與根長相關的QTL分別位于第3號染色體的Indel29～RM232區(qū)間內(nèi)和第5號染色體的Indel45～Indel43 區(qū)間內(nèi)，qARL3和qARL5貢獻分別為7.04%，8.88%，增效等位基因分別來自DN425和CB10。

在自然條件與鹽脅迫的差值條件下，共檢測到4個與根根數(shù)、根長相關的QTL，分布在第1，7，8號染色體上。檢測到了2個與根數(shù)相關的QTL，都位于8號染色體上，分別位于RM1384～Indel69和Indel74～Indel71區(qū)間內(nèi)，貢獻率為6.99%和14.01%，其中，qN-SRN8-1的增效等位基因來自于DN425，qN-SRN8-2的則來自于CB10；并且檢測到了2個與根長相關的QTL，位于1號染色體的Indel8～Indel4區(qū)間內(nèi)和7號染色體的Indel62～RM418 區(qū)間內(nèi)，貢獻率分別為14.12%和9.40%，其中qN-SRL1的增效等位基因來自CB10，qN-SRL7的增效等位基因來自DN425。

在自然條件與堿脅迫的差值條件下，共檢測到2個與根數(shù)、根長相關的QTL，分布在第3，10號染色體上。第3號染色體上的QTL在區(qū)間RM1230～RM1352內(nèi)與根數(shù)相關，貢獻率為6.02%，qN-ARN3的增效等位基因來自DN425；檢測到1個與根長相關的QTL，位于第10號染色體的Indel94～Indel88區(qū)間內(nèi)，貢獻率為7.45%，其中，qN-ARL10的增效等位基因來自CB10。

表3 水稻苗期耐鹽堿性的QTL及遺傳效應Tab.3 QTL and gentic effects of salt and alkali tolerance

注：QTL命名中的第一個大寫字母N、S、A代表自然條件、鹽脅迫條件、堿脅迫條件；N-S、N-A則代表自然條件與鹽脅迫、堿脅迫的差值。

Note：The first capital letter N，S and A represent natural conditions，salt stress and alkaline stress；And N-S and N-A represent the difference between natural conditions and salt stress and alkali stress.

2.4 構建遺傳連鎖圖譜

利用125對SSR引物對RIL群體進行基因型鑒定，構建遺傳連鎖圖譜，其總長為2 387.33 cM，覆蓋水稻12條染色體，標記間平均距離為11.10 cM(圖2)。

3 討論與結論

水稻的耐鹽性以及耐堿性是復雜的數(shù)量性狀，在試驗中測得的根數(shù)與根長也易受到外界環(huán)境條件的影響。所以，在對比研究自然條件與鹽脅迫條件和堿脅迫條件下其QTL的表現(xiàn)規(guī)律時，必須將與本試驗無關的環(huán)境因子對結果的影響消除。所以，本試驗是在溫室內(nèi)進行的，并且在試驗過程中保證它們具有相同的土肥條件。

在之前的苗期耐鹽性及耐堿性的研究當中，CB10比DN425有較強的耐鹽、堿性[17]，而由這2個品種建立起來的RIL群體也被證明是一個有效的作圖群體[14]。因此，在本試驗中，大多數(shù)QTL提供加性效應的等位基因來源于親本CB10。

通過對自然條件與鹽、堿脅迫條件下總共檢測到18個QTL，自然條件下檢測到4個(36. 19 %)，鹽脅迫環(huán)境中檢測到5個(55.85%)，堿脅迫條件中檢測到3個(28.91%)，在自然條件與鹽脅迫差值下檢測到4個(44.52%)，在自然條件與堿脅迫差值下檢測到2個(13.47%),說明不同的QTL在各自的環(huán)境中更為有效。檢測出在7號染色體上包含多個QTL的位點，在該染色體上定位到的QTL中，qNRN7-1和qSRN7 2個QTL的標記區(qū)間相鄰，分別位于第7號染色體的RM182～RM346區(qū)間和RM560～RM182區(qū)間，貢獻率為7.89% 和 7.01%。在自然條件下檢測到qNRN7-2位于7號染色體上，貢獻率為12.46%；在鹽脅迫下檢測到qSRN3位于3號染色體上，貢獻率為20.06%；在堿脅迫下檢測到qARN2位于 2 號染色體上，貢獻率為12.99%；在自然條件與鹽脅迫的差值下檢測到位于第 8 號染色體的qN-SRN8-2和位于1號染色體的qN-SRL1，貢獻率分別為14.01%和14.12%；在自然條件與堿脅迫的差值下檢測到位于第10號染色體的qN-ARL10，貢獻率為7.45%。在所統(tǒng)計的10個性狀中，鹽脅迫下檢測到的QTL最多，且總貢獻率達到了55.85%，其中位于3號染色體上的qSRN3，貢獻率達到20.06%，且被證實來源于CB10。

圖2鹽、堿脅迫條件下水稻苗期根數(shù)、根長QTL在染色體上的分布
Fig.2RootnumberandrootlengthQTLundersaltandalkalinestressattheseedlingstageinriceonchromosomes

本研究在相同的SSR標記或比較圖譜的基礎上，將與根數(shù)和根長相關的QTL與耐鹽耐堿QTL結果進行比較。在自然條件下，第7號染色體一起定位到的與根數(shù)相關的qNRN7-1與影響相對分蘗數(shù)的qRTN7-4和影響結實率的qRSS7-2定位在相鄰區(qū)間[18-19]；另外，在第10號染色體上定位到的qNRN10與影響葉綠素含量相對堿害率的qRCC10定位在相鄰區(qū)間[20]。在鹽脅迫下，本研究定位到的qSRN7與影響千粒質(zhì)量的qRGW7定位在相鄰區(qū)間[19]，與影響株高的qPH7-1定位在相同區(qū)間[18]；另外，本研究定位到的qSRN1與影響相對分蘗數(shù)的qRTN1在相鄰區(qū)間[18]；在第3號染色體定位到的qSRN3與影響單株有效穗數(shù)的qPN3-2定位到相鄰區(qū)間[19]。在堿脅迫下，qARL3與影響堿脅迫下根部Na+濃度的qARNC3以及影響堿脅迫下根部Na+/K+的qARNK3定位在相鄰區(qū)間[14]。在自然條件與鹽脅迫的差值條件下，定位在第8號染色體的qN-SRN8-1與影響葉相對Na+含量的qRLNC8、與影響葉Na+/K+的qLNa/K8定位在相鄰區(qū)間[18]。在自然條件與堿脅迫的差值條件下，定位在第3號染色體的qN-ARN3與影響單株有效穗數(shù)的qPN3-3定位在相鄰區(qū)間[19]。結果表明，QTL可以在不同的環(huán)境、不同的遺傳背景、不同的指標下進行檢測，這些QTL穩(wěn)定可靠，對水稻的耐鹽性和耐堿性研究具有重要的意義。

在鹽脅迫和堿脅迫條件下，水稻的根數(shù)和根長都受到明顯影響，其中在堿脅迫條件下水稻更為敏感，苗期根系的根數(shù)和根長降低更明顯。從QTL定位的結果也能反映出在鹽脅迫和堿脅迫條件下根長和根數(shù)遺傳機理存在聯(lián)系但也存在差異，還需進一步結合其他根系性狀進行研究。