逯臘虎，楊 斌，張 婷，張 偉，袁 凱，史曉芳，彭惠茹，倪中福，孫其信

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所，山西 臨汾 041000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物遺傳育種系，北京 100193)

灌漿期是小麥(TriticumaestivumL.)產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期[1-2]，作為灌漿期最重要的光合器官，旗葉為小麥籽粒干質(zhì)量的形成貢獻(xiàn)了30%～50%的光合同化產(chǎn)物[3-5]。旗葉對產(chǎn)量的影響主要是通過對穗粒數(shù)、穗粒質(zhì)量與千粒質(zhì)量的調(diào)控而實現(xiàn)[4，6]，前人研究結(jié)果表明，旗葉的形態(tài)指標(biāo)如葉長、葉寬、葉面積等性狀對穗粒數(shù)、穗粒質(zhì)量與千粒質(zhì)量均具有較大的影響。錢雪婭[7]研究發(fā)現(xiàn)，灌漿期小麥旗葉的長、寬與千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。傅兆麟等[8]研究表明，小麥旗葉的長、寬、葉面積與穗粒數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)。王義芹等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，小麥旗葉面積與單株生物產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。因此，對小麥旗葉形態(tài)指標(biāo)與籽粒相關(guān)性狀進(jìn)行遺傳剖析，從遺傳機理角度深入解析這些緊密關(guān)聯(lián)性狀的相互關(guān)系，可為小麥高產(chǎn)育種與分子聚合育種提供理論數(shù)據(jù)支撐。

近年來，得益于分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，在小麥旗葉性狀[10-17]、籽粒性狀[18-23]的遺傳機理研究方面已取得一定的進(jìn)展。Garcia-Suarez等[10]利用包含114個家系的RIL群體，分別在2A、2D和6D染色體上檢測到了控制葉面積的QTL。Xie等[12]以Forno×Oberkulmer構(gòu)建的RIL群體，共檢測到了21個控制葉面積的QTL；常鑫等[14]利用小偃81×西農(nóng)1376構(gòu)建的RIL群體，分別檢測到9個控制葉長、10個控制葉寬以及12個控制葉面積的QTL。然而，旗葉性狀與籽粒性狀均是復(fù)雜的數(shù)量性狀，容易受到環(huán)境的影響[11]，這就要求用于遺傳分析的初級定位群體家系數(shù)目不能太少、遺傳圖譜標(biāo)記間的平均距離不能過大、并且需要進(jìn)行多個環(huán)境下的驗證[24]，以此降低QTL檢測的假陽性，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)的QTL。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，此前關(guān)于小麥旗葉性狀的遺傳研究或多或少存在一些不足。此外，目前尚未見到從遺傳關(guān)系的角度分析小麥旗葉大小與穗粒數(shù)、穗粒質(zhì)量與千粒質(zhì)量這些緊密關(guān)聯(lián)性狀的研究報道，而基于不同遺傳群體的分析結(jié)果往往因為遺傳背景的不同無法直接進(jìn)行相互比較[25]。

本研究以農(nóng)大3338×京冬6號構(gòu)建的包含216個家系的DH群體為材料，構(gòu)建了包含469個SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，并進(jìn)行了2年共計4個環(huán)境下的表型值測定，以期發(fā)掘能夠穩(wěn)定表達(dá)的QTL，并從遺傳機理角度深入解析旗葉大小與籽粒性狀這些緊密關(guān)聯(lián)性狀的相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究利用農(nóng)大3338和京冬6號構(gòu)建的DH群體包含216個家系。其中，母本農(nóng)大3338是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的優(yōu)良矮稈親本，父本京冬6號是北京市延慶縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的水地高產(chǎn)品種[26]。

1.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

采用Mapmaker version 3.0構(gòu)建了小麥DH群體(農(nóng)大3338×京冬6號)的遺傳連鎖圖，總長度為2 205.93 cM，469個SSR標(biāo)記被錨定在小麥的21條染色體上，每條染色體上平均有22.33個標(biāo)記，平均2個標(biāo)記的距離為4.7 cM。

1.3 田間試驗及性狀調(diào)查

于2015，2016年將DH群體及其親本分別種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所試驗站(臨汾市)與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所試驗站(運城市)，2年共計4個環(huán)境，分別記為E1(2015臨汾)、E2(2016臨汾)、E3(2015運城)和E4(2016運城)。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，雙行區(qū)種植，行長1.5 m，行距0.25 m，重復(fù)3次，按常規(guī)栽培技術(shù)進(jìn)行管理。

于開花10 d時，在親本與每個家系中選取發(fā)育正常、長勢一致的10株小麥進(jìn)行旗葉長(Flag leaf length，F(xiàn)LL)、旗葉寬(Flag leaf width，F(xiàn)LW)的測定，并根據(jù)公式計算旗葉面積(Flag leaf area，F(xiàn)LA)(旗葉面積=長×寬×0.83)。小麥成熟后，將掛牌標(biāo)記的小麥?zhǔn)斋@，進(jìn)行千粒質(zhì)量(Thousand grain weight，TGW)、穗粒數(shù)(Grain number per spike，GNS)、穗粒質(zhì)量(Grain weight per spike，GWS)的測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析及QTL定位

采用Excel和SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件(IBM SPSS，Somers，NY，USA)對小麥DH群體以及雙親各表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異范圍、變異系數(shù)、偏度、峰度以及方差分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 各家系與親本旗葉相關(guān)性狀的表型變異分布

由表1可知，4個環(huán)境條件下，雙親之間旗葉寬的差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，而父本京冬6號旗葉長、葉面積與母本農(nóng)大3338之間差異均達(dá)顯著(P>0.05)或極顯著(P<0.01)水平，說明雙親之間葉面積的差異主要是通過葉長的變化引起的。

4個環(huán)境條件下，雙親的旗葉長、寬和面積表型值均介于DH群體的最小值與最大值之間(表1)，表明控制葉性狀的有利等位基因在群體之間得到了廣泛分離。4個環(huán)境中，偏度與峰度的絕對值均小于1，表明群體之間葉性狀呈現(xiàn)出連續(xù)性正態(tài)分布，適宜于進(jìn)行QTL分析。

2.2 各家系與親本籽粒相關(guān)性狀的表型變異分布

由表2可知，4個環(huán)境條件下，雙親除E2、E4的穗粒質(zhì)量與E1、E2穗粒數(shù)差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)外，其余籽粒性狀差異均達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。與葉性狀趨勢類似，4個環(huán)境條件下，雙親的籽粒性狀表型值也均介于DH群體的最小值與最大值之間(表2)，說明籽粒性狀也呈現(xiàn)典型數(shù)量性狀的特征，可進(jìn)行QTL分析。

表1 不同環(huán)境下DH群體與親本旗葉長、寬和面積的表型變異Tab.1 The variation of flag leaf length，flag leaf width and flag leaf area of parents and DH (doubled haploid)lines under different environments

注：*.差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；**.差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)；ns.差異未達(dá)到顯著水平。表2同。

Note：*.Significant difference at 0.05 level；**.Significant difference at 0.01 level；ns.Not significant difference. The same as Tab.2.

表2 不同環(huán)境下DH群體與親本千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和穗粒質(zhì)量的表型變異Tab.2 The variation of thousand-grain weight，grain number per spike and grain weight per spike of parents and DH(doubled haploid)lines under different environments

2.3 旗葉長、寬和面積的加性QTL分析

4個環(huán)境中，共檢測到40個旗葉性狀的加性QTL，位于除1D、3A、3D、5B、5D、6B、7A、7B和7D外的其余12條染色體上，其中，19個QTL(47.50%)位于A染色體組，12個QTL(30.00%)位于D染色體組，B染色體組上的QTL最少，僅有9個(22.50%)。這些旗葉性狀QTL閾值介于2.35～7.33，能夠解釋表型變異的3.67%～26.77%(表3)。

10個控制旗葉長的QTL對表型變異的貢獻(xiàn)率為4.19%～15.32%，其中，Qfll-1B.1、Qfll-4A.2和Qfll-5A.1對表型的貢獻(xiàn)率大于10%，是控制旗葉長的主效QTL。Qfll-2B(E3、E4)、Qfll-4A.2(E1、E2)和Qfll-5A.1(E3、E4)能夠在2個環(huán)境條件下被同時檢測到。

14個旗葉寬的QTL對表型變異的貢獻(xiàn)率介于4.52%～26.77%，其中，6個QTL(Qflw-2D.2、Qflw-4A.1、Qflw-4B.1、Qflw-4D.1、Qflw-6D.1和Qflw-6D.2)是控制旗葉寬的主效QTL。5個QTL(Qflw-4A.1、Qflw-4A.3、Qflw-4B.1、Qflw-4D.1和Qflw-6D.1)分別能在2個或2個以上環(huán)境條件下被檢測到，其中，位于4B染色體Xcau506～Xwmc141標(biāo)記區(qū)間的Qflw-4B.1能在4個環(huán)境中同時被檢測到，解釋表型變異的13.88%～26.77%，說明該QTL可能具有不受環(huán)境影響穩(wěn)定表達(dá)的特點。此外，位于4A、4D染色體上的2個旗葉寬QTL(Qflw-4A.1、Qflw-4D.1)在E1、E2、E3環(huán)境中也均能被檢測到。

表3 不同環(huán)境下旗葉長、寬和面積的加性QTLTab.3 Additive effect of quantitative trait loci (QTLs) for flag leaf length， flag leaf width and flag leaf area under different environments

注：R2為加性QTL對表型值變異貢獻(xiàn)率。表4同。

Note：R2is rate of contribution explained by the additive QTL. The same as Tab.4.

共檢測到16個旗葉面積的QTL，貢獻(xiàn)率為3.67%～21.88%，其中，5個QTL(Qfla-2D.3、Qfla-4A.2、Qfla-4A.4、Qfla-4B和Qfla-6D)能在2個或3個環(huán)境條件下被檢測到。4個QTL(Qfla-2D.3、Qfla-4A.1、Qfla-4A.4、Qfla-4B)為控制旗葉面積的主效QTL，其中，位于2D染色體上Xcfd53～Xcfd2標(biāo)記區(qū)間的QTL(Qfla-2D.3)在E1、E2這2種環(huán)境條件下對表型的貢獻(xiàn)率為20.08%和21.88%。

2.4 千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和穗粒質(zhì)量的加性QTL分析

從表4可以看出，4個環(huán)境條件下，共有65個籽粒性狀的QTL在除1A、3D和5B之外的18條染色體上被檢測到，其中，B染色體組上檢測到的籽粒性狀QTL數(shù)量最多，為30個，占籽粒性狀QTL總數(shù)的46.15%，A染色體組上共檢測到24個QTL(36.92%)，D染色體組上最少，僅為11個(16.92%)。

表4 不同環(huán)境下千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和穗粒質(zhì)量的加性QTLTab.4 Additive effect of quantitative trait loci (QTLs) for thousand-grain weight，grain number per spike and grain weight per spike under different environments

表4(續(xù))

檢測到24個千粒質(zhì)量相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率介于2.28%～39.91%，其中，有9個QTL為控制千粒質(zhì)量的主效QTL；8個QTL能在2個或2個以上環(huán)境中被檢測到，占千粒質(zhì)量QTL總數(shù)的33.33%。位于4A、4B染色體上的3個QTL(Qtgw-4A.1、Qtgw-4B.2和Qtgw-4B.3)分別能在3個(E1、E2、E4)、3個(E1、E3、E4)和4個環(huán)境中被檢測到，其中，位于4B染色體Xcau506～Xwmc141標(biāo)記區(qū)間的QTL(Qtgw-4B.3)在4個環(huán)境下對表型的貢獻(xiàn)率為19.43%～39.91%。

共檢測到23個穗粒質(zhì)量的QTL，對表型的貢獻(xiàn)率為3.75%～26.82%，其中，有5個QTL能在2種環(huán)境中同時被檢測到。有5個QTL為控制穗粒質(zhì)量的主效QTL，對表型的貢獻(xiàn)率為10.55%～26.82%，其中，位于4B染色體上Xcau506～Xwmc141標(biāo)記區(qū)間的QTL(Qgws-4B.3)能夠在E2環(huán)境下解釋表型變異的26.82%。

4個環(huán)境條件下共檢測到18個穗粒數(shù)的QTL，能夠解釋表型值變異的3.89%～26.52%，其中，5個為穗粒數(shù)的主效QTL，對表型的貢獻(xiàn)率介于10.12%～26.52%。位于4A染色體Xcau467～Xbarc343標(biāo)記區(qū)間的QTL(Qgns-4A.2)在E4環(huán)境中對表型的貢獻(xiàn)率為26.52%。未檢測到能在多個環(huán)境下同時表達(dá)的控制穗粒數(shù)的QTL。

3 討論

3.1 旗葉性狀與籽粒性狀遺傳關(guān)聯(lián)解析

小麥?zhǔn)侨澜缱钪匾闹骷Z作物之一，提高產(chǎn)量一直是小麥育種家亙古不變的目標(biāo)。旗葉是小麥花后主要的光合器官，大量研究表明，旗葉的長、寬和面積與小麥千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)和穗粒質(zhì)量具有緊密的正相關(guān)性[9]，即合理地增大旗葉長、寬和面積，可以增加光合面積，促進(jìn)光合產(chǎn)物的形成，最終實現(xiàn)小麥產(chǎn)量的提高。此外，已有研究證實，控制關(guān)聯(lián)性狀的QTL在染色體上并不是均勻分布的，而是傾向于分布在相同或相近的QTL區(qū)間，即關(guān)聯(lián)性狀通常由緊密連鎖的QTL調(diào)控，這一現(xiàn)象被稱為QTL的“一因多效”或緊密連鎖[27]。Keller等[28]在2A、4A和5A染色體上發(fā)現(xiàn)了多個能夠同時影響小麥形態(tài)與產(chǎn)量這些緊密相關(guān)性狀的QTL，這些QTL位于相同標(biāo)記區(qū)間；Sourdille等[29]在2B染色體Xfbb121～XE38M60標(biāo)記區(qū)間與7B染色體Xfbb121～XksuD18標(biāo)記區(qū)間檢測到2個同時控制光周期與抽穗期的QTL；Zhang等[30]利用包含168個家系的DH群體為材料，在4B染色體Xwmc718～Xwmc262標(biāo)記區(qū)間同時檢測到了控制葉綠素含量和產(chǎn)量的QTL，在5D染色體Xbarc320～Xwmc215～Xgdm63標(biāo)記區(qū)間同時檢測到了控制葉綠素含量、產(chǎn)量、抽穗期和開花期的QTL；王文文等[31]利用包含187個株系的RIL群體為材料，在5A染色體Xcfa2149～Xgpw2136標(biāo)記區(qū)間檢測到1個千粒質(zhì)量和灌漿速率QTL。本研究也在1B、2A、2B、2D、3A、4A、4B、4D、6A、6D和7A染色體上發(fā)現(xiàn)多個調(diào)控緊密關(guān)聯(lián)性狀的QTL富集區(qū)。在1B染色體Xcfd48～Xbarc349標(biāo)記區(qū)間同時檢測到1個旗葉長QTL(Qfll-1B.3)、1個旗葉面積QTL(Qfla-1B)、1個千粒質(zhì)量QTL(Qtgw-1B.2)，并在相鄰的Xbarc349～Xbarc308a標(biāo)記區(qū)間檢測到1個千粒質(zhì)量QTL(Qtgw-1B.3)；2D染色體Xcfd53～Xcfd2標(biāo)記區(qū)間同時檢測到1個旗葉寬QTL(Qflw-2D.2)、1個葉面積QTL(Qfla-2D.3)、1個穗粒質(zhì)量QTL(Qgws-2D.1)和1個千粒質(zhì)量QTL(Qtgw-2D.2)；4A染色體Xksm71～Xwmc161標(biāo)記區(qū)間同時檢測到1個旗葉長QTL(Qfll-4A.1)、1個旗葉寬QTL(Qflw-4A.4)、1個旗葉面積QTL(Qfla-4A.3)和1個穗粒數(shù)QTL(Qgns-4A.1)。在這些富集區(qū)段中，相同標(biāo)記區(qū)間檢測到的旗葉性狀QTL與籽粒性狀QTL均具有相同方向的效應(yīng)值，即同為正值或同為負(fù)值，這個現(xiàn)象一方面從QTL水平證實了旗葉長、寬、面積和千粒質(zhì)量、穗粒質(zhì)量、穗粒數(shù)是高度相關(guān)的，另一方面對這種QTL富集區(qū)域進(jìn)行深入研究與挖掘，找出穩(wěn)定表達(dá)的QTL，可為MAS育種與分子聚合育種提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 QTL表達(dá)的一致性分析

QTL定位結(jié)果容易受到遺傳背景、群體大小等因素的影響，因此，利用不同的作圖群體檢測控制同一性狀的QTL，其結(jié)果往往很難具有復(fù)現(xiàn)性[32]。本研究也證實了這一現(xiàn)象，即本研究中檢測到的105個旗葉與籽粒性狀的QTL中，僅有極少數(shù)與前人報道重合。趙朋[33]在1B染色體Xgwm268～wmc134標(biāo)記區(qū)間檢測到1個旗葉長的QTL，本研究也在Xgwm268標(biāo)記附近檢測到了1個旗葉長QTL；Fan等[11]在4A染色體Xwmc161～Xgpw2331～Xwpt-4230～Xgpw7543標(biāo)記區(qū)間檢測到多個控制旗葉長、寬、面積及籽粒性狀QTL，本研究也在Xwmc161標(biāo)記附近檢測到了1個旗葉長QTL、1個旗葉寬QTL、1個旗葉面積QTL和1個穗粒數(shù)QTL；Wu等[34]在2D染色體Xcfd53標(biāo)記區(qū)間附近檢測到1個穗粒質(zhì)量QTL；Deng等[35]在Xcfd53標(biāo)記區(qū)間附近檢測到1個穗長QTL；Zhang等[30]在Xcfd53標(biāo)記區(qū)間附近檢測到1個旗葉葉綠素含量QTL和1個產(chǎn)量QTL，本研究也在Xcfd53標(biāo)記區(qū)間附近檢測到1個旗葉寬QTL、1個旗葉面積QTL、1個千粒質(zhì)量QTL和1個穗粒質(zhì)量QTL。由于作圖群體、所使用分子標(biāo)記類型不同，很多QTL無法對比是否是同一QTL區(qū)間，但通過對比前人研究仍可發(fā)現(xiàn)一些共性：Garcia-Suarez等[10]在2D染色體上檢測到多個旗葉性狀的QTL；常鑫等[14]在1A、2D、4A染色體上檢測到多個旗葉性狀的QTL。閆雪等[15]在4A染色體上、呂學(xué)蓮等[16]在1B、2D、4B染色體上均發(fā)現(xiàn)了多個旗葉性狀的QTL，本研究也在上述染色體上發(fā)現(xiàn)了控制旗葉性狀的多個富集區(qū)。此外，本研究中檢測到的5個具有較高貢獻(xiàn)率的QTL(Qflw-4B.1、Qflw-4D.1、Qfla-4B、Qtgw-4B.2、Qtgw-4B.3)則未見前人報道過，這些QTL可能是新發(fā)現(xiàn)的QTL，對旗葉性狀與籽粒性狀的遺傳資源挖掘具有重要意義。

3.3 環(huán)境影響與穩(wěn)定表達(dá)的QTL

旗葉長、寬、面積和千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)、穗粒質(zhì)量都是典型的數(shù)量性狀，控制這些性狀的基因容易受到環(huán)境影響[4-16]，絕大多數(shù)只在特定的環(huán)境條件下才能表達(dá)[25]，而這些依賴于特定環(huán)境表達(dá)的QTL，一般不能用于MAS育種，只有在多個環(huán)境能夠被多次重復(fù)檢測到的QTL才被視為是環(huán)境間穩(wěn)定表達(dá)的QTL[32]。本研究中共檢測到105個旗葉性狀與籽粒性狀的加性QTL，其中能在4個環(huán)境中同時檢測到的QTL僅為2個，在3個環(huán)境中同時被檢測到的為5個，2個環(huán)境中被檢測到的QTL為19個，其余79個QTL均為依賴于環(huán)境特異表達(dá)的QTL。QTL定位的最終目的是能檢測到在多個環(huán)境條件下穩(wěn)定表達(dá)的QTL，本研究在3種或3種以上環(huán)境中被重復(fù)檢測到的7個穩(wěn)定表達(dá)的QTL為：Qflw-4A.1、Qflw-4B.1、Qflw-4D.1、Qfla-4B、Qtgw-4A.1、Qtgw-4B.2、Qtgw-4B.3。這些QTL都具有較高的LOD值(最高為17.93)，并對表型具有較高的貢獻(xiàn)率(最高能解釋表型變異的39.91%)，這也與前人研究結(jié)果一致。對這7個穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL進(jìn)行深入挖掘與精細(xì)定位，對于MAS育種和基因克隆具有重要的意義。