陳金發(fā)，張 云，向地玖，殷敏超，余 玲

(1.西昌學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，四川 西昌 615013； 2.西昌學(xué)院土木與水利工程學(xué)院，四川 西昌 615013)

0 引 言

微生物絮凝劑是微生物或其分泌物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物能將某些廢水中的懸浮顆粒、膠體粒子和有機(jī)物等絮凝沉降[1]。微生物絮凝劑不僅具有絮凝沉降廢水的作用，同時具有自身降解的能力，是一類無毒、安全、環(huán)保、不造成二次污染的絮凝劑[2]。目前關(guān)于微生物絮凝劑篩選和去除效果的研究方興未艾，它是環(huán)保生物新材料的重要研究方向。在用微生物絮凝劑處理污水方面，國內(nèi)外專家也進(jìn)行了相關(guān)研究，如Junyuan Guo等采用篩選于活性污泥的微生物絮凝劑處理畜禽廢水，在最優(yōu)條件處理時，COD的處理效率為87.9%[3]。胡筱敏等篩選得到一株Bacillus mucilgnonsn.var，該菌株在處理淀粉生產(chǎn)中的黃漿廢水效果優(yōu)于目前廣泛使用的PAC和PAM[4]。Ahmad H.RaJab Aljuboori等研究了一種新型微生物絮凝劑PM-5，并應(yīng)用于處理河水的濁度，去除率達(dá)到63%[5]。微生物絮凝劑在生產(chǎn)過程中特別容易受到有毒物質(zhì)的影響，因此，在制備過程中，一定要保證產(chǎn)絮微生物不被污染，培養(yǎng)環(huán)境無毒無害。目前，對微生物絮凝劑的研究程度還不夠深入，而且應(yīng)用領(lǐng)域大都局限在濁度的去除上。

本實(shí)驗(yàn)通過對比DEHP篩選法、吡啶篩選法、傳統(tǒng)篩選法三種篩選方法，篩選出穩(wěn)定、高效的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌并研究了該菌株處理生活污水中COD的影響因素。實(shí)驗(yàn)可為微生物絮凝劑在生活污水處理中的進(jìn)一步應(yīng)用提供較好的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 微生物絮凝劑菌的篩選

1.1.1 樣品的采集

本實(shí)驗(yàn)篩選微生物絮凝劑的樣品分別取自農(nóng)村玉米地土壤、污水溝底泥及生活污水廠污泥。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的分離和篩選是非常重要且工作量較大的環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)通過對比傳統(tǒng)篩選法、吡啶篩選法和DEHP篩選法三種篩選方法的優(yōu)劣，并從中篩選出絮凝效果高的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌。

(1)傳統(tǒng)篩選法。將各種環(huán)境樣品接種到需要的富集培養(yǎng)基中，通過富集培養(yǎng)，稀釋涂布等方法，挑選出生長較好、表面光滑帶黏性的單體菌落，再通過測定高嶺土懸浮液的絮凝效果對挑選出的菌種進(jìn)行篩選，得出絮凝效果好的菌種[6]。

(2)吡啶篩選法。吡啶篩選法是將樣品直接接入吡啶培養(yǎng)基，吡啶作為氮源，使得可以耐受吡啶的微生物生存下來，然后進(jìn)行分離，得到單菌。通過絮凝測試，獲得高效的絮凝劑產(chǎn)生菌。

(3)DEHP篩選法。日本學(xué)者倉根隆一郎(Ryuichiro Kurane)等通過研究最終分離篩選出一株能夠分解利用苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的菌種——紅平紅球菌(Rhodococcus enythropolis)，并進(jìn)一步研制由紅平球菌產(chǎn)生的能夠沉降活性污泥的微生物絮凝劑，取名為NOC-1。降解DEHP和DBP可能與微生物絮凝劑的產(chǎn)生有一定的內(nèi)在聯(lián)系[7]。因此本研究采用DEHP作為唯一碳源的篩選方法進(jìn)行絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選與其他篩選方法進(jìn)行比較。

1.2 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的16S rDNA鑒定

1.2.1 提取細(xì)菌基因組DNA

使用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒(Axygen，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司)提取菌株DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

(1)16Sr RNA/DNA PCR的通用擴(kuò)增引物。Pimer1：27F(5’to 3’AGAGTTTGATC CTGG CTCAG)；Pimer2：1492R (5’to 3’GGTTACCTT G TTA GTTACGACTT)。

(2)50μL PCR反應(yīng)體系。Mater Mix：25 μL；Primer 27F：1 μL；Primer 1492R：1 μL；Water：22 μL；模板DNA：1 μL。

(3)PCR擴(kuò)增條件。94 ℃下預(yù)變性4 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性1 min，53 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，在72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃下進(jìn)行保藏。檢測出目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到成都飛騰博川(瑞信)生物公司進(jìn)行測序。

1.3 微生物絮凝劑處理生活污水中的COD的影響因素

采集生活污水，初始COD濃度為300～500 mg/L。采用序批式實(shí)驗(yàn)研究微生物絮凝劑處理生活污水中COD不同因素如投加量、pH值、溫度、振蕩轉(zhuǎn)速、氯化鈣等的影響。取100 mL生活污水于250 mL燒杯中，調(diào)節(jié)到所需的pH值，在加入微生物絮凝劑后放入恒溫培振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理。COD采用重鉻酸鉀法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

對比3種篩選方法，篩選結(jié)果如表1所示。

表1 三種篩選方法的結(jié)果對比Tab.1 Comparision of the three sreening methods

利用傳統(tǒng)篩選法，從樣品中篩選出具有絮凝效果的菌種20株，具有高效絮凝效果的有6株；吡啶篩選法選出的菌種有11株，其中具有高效絮凝效果的菌種有2株，在高嶺土懸濁液中發(fā)揮很好的絮凝效果，絮凝速度快，效果也好；DEHP篩選法選出的菌種只有3株，并且選出的菌種絮凝效果一般。綜上所述，本研究最終采用傳統(tǒng)篩選法。

對農(nóng)村玉米地土壤、污水溝底泥及生活污水廠污泥三個樣品采用傳統(tǒng)篩選法進(jìn)行篩選，最終污水溝底泥篩選出最高絮凝率的一個菌株，絮凝率達(dá)95%。對產(chǎn)絮凝劑菌株按上述方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。利用Genbank處理測序結(jié)果，應(yīng)用BLAST程序?qū)enbank數(shù)據(jù)庫里的信息進(jìn)行待測序列的同源性搜索，繪制出的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。

圖1表明產(chǎn)絮凝劑菌株與同類型的菌株路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)相似性最高84%。

2.2 各因素對微生物絮凝劑處理生活污水中COD的影響規(guī)律

2.2.1 pH值的影響

加入4 mL微生物絮凝劑于生活污水中，調(diào)節(jié)pH值分別到1～9，并分別進(jìn)行振蕩批次實(shí)驗(yàn)，振蕩溫度設(shè)定為30 ℃，先快速(200 r/min)振蕩1 min，再慢速(60 r/min)振蕩 3min。振蕩完成后，靜置3 min后取樣測定COD。結(jié)果見圖2。

如圖2所示，pH值為2～7時，COD的去除率隨著pH值的升高而增大。pH值為2～5時，COD的去除率由2.03%增加到14.22%。當(dāng)pH值為5～7時，COD的去除率有大幅增加，且產(chǎn)生礬花。在pH值為7時，達(dá)到最高的COD去除率45.34%。pH>7時，COD去除率迅速降低。COD去除率的變化可能與pH值影響了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞酶促反應(yīng)的效率有關(guān)[8]。

2.2.2 投加量的影響

調(diào)節(jié)生活污水pH值為7，分別加入0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、4、6 mL微生物絮凝劑，振蕩溫度設(shè)定為30 ℃，先快速(200 r/min)振蕩1 min，再慢速(60 r/min)振蕩 3 min。振蕩完成后，靜置3 min取樣測定COD。結(jié)果見圖3。

圖1 基于16S rDNA序列的產(chǎn)絮凝劑菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the flocculant based on 16S rDNA

圖2 pH值對COD的去除效果的影響Fig.2 Effect of pH on COD removal

圖3 投加量值對COD的去除效果的影響Fig.3 Effect of bioflocculant dosage on COD removal

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明絮凝劑投加量在0.01～1 mL范圍內(nèi)，COD的去除率隨著投加量的增多而增大。在投加量為1 mL時達(dá)到最佳去除效果，去除率達(dá)到41.7%。隨著投加量的增多，COD的去除率隨投加量的增大而降低。因此，絮凝劑投加量較多或者較少都對COD的去除率有抑制作用。當(dāng)添加的絮凝劑過量時，它們之間強(qiáng)烈的排斥作用又會對COD的吸附起到抑制作用[9,10]。

2.2.3 振蕩溫度的影響

調(diào)節(jié)生活污水pH值為7，加入1 mL微生物絮凝劑，調(diào)節(jié)振蕩溫度為20、25、30、35、40 ℃，先快速(200 r/min)振蕩1 min，再慢速(60 r/min)振蕩3 min。振蕩完成后，靜置3 min取樣測定COD。結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對COD去除效果的影響Fig.4 Effect of temperature on COD removal

如圖4所示，在20～40 ℃之間，去除率有所上升，去除率在44%之間波動，最佳振蕩溫度為30 ℃，去除率達(dá)45% 。當(dāng)超過40 ℃時，絮凝率迅速降低。這可能與如下原因有關(guān)。在一定的溫度范圍內(nèi)，微生物機(jī)體的生長繁殖和代謝活動隨著溫度的上升而增加，但當(dāng)溫度上升或下降到一定程度，因機(jī)體的重要組成部分如蛋白質(zhì)、核酸等都對溫度敏感程度較強(qiáng)就會對有機(jī)體產(chǎn)生不利的影響，導(dǎo)致細(xì)胞功能急劇下降甚至死亡[11,12]。

2.2.4 氯化鈣的影響

調(diào)節(jié)生活污水pH值為7，加入1 mL微生物絮凝劑，再分別加入0.1、0.2、0.8、1.4、2.0 mL濃度為2.5%的氯化鈣溶液，放入振蕩箱中，調(diào)節(jié)溫度為30 ℃，先快速(200 r/min)振蕩1 min，再慢速(60 r/min)振蕩3 min。振蕩完成后，靜置3 min取樣測定COD。結(jié)果見圖5。

圖5 氯化鈣對COD去除效果的影響Fig.5 Effect of calcium chloride on COD removal

金屬陽離子的助凝作用，是由于其能有效地降低被絮凝物的表面電荷，壓縮雙電層，從而加強(qiáng)復(fù)合菌產(chǎn)絮凝劑與膠粒間的吸附力，促進(jìn)網(wǎng)狀架橋的形成，使被絮凝物顆粒發(fā)生聚集沉降[13,14]。

如圖5所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氯化鈣的投加量在0.1～0.8 mL范圍內(nèi)，COD的去除率隨著投加量的升高而增大，在0.8 mL(5.33 mL/L)時，去除率最好，達(dá)到了72.2%，在0.8～2.0范圍內(nèi)，COD的去除率隨氯化鈣投加量升高而降低。尤其在投加量為2.0 mL時，COD去除率急劇下降。說明過量的Ca2+會嚴(yán)重抑制微生物絮凝劑的活泩[15]。

3 結(jié) 語

(1)通過傳統(tǒng)篩選法、DEHP篩選法和吡啶篩選法優(yōu)選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌。傳統(tǒng)篩選法較其他兩種方法的篩出率更高。研究中利用傳統(tǒng)篩選法從污水溝底泥中篩選出一株微生物絮凝劑產(chǎn)生菌，經(jīng)過16S rDNA鑒定其屬于路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)，該菌株對高玲土懸浮液去除率為95%。

(2)在最佳環(huán)境條件pH值為7.0，溫度30 ℃，微生物絮凝劑投加量為1 mL，氯化鈣投加量為0.8 mL時，先快速(200 r/min)振蕩1 min，再慢速(60 r/min)振蕩3 min后，COD去除率可達(dá)到最高的72.2%。

(3)通過實(shí)驗(yàn)研究表明，微生物絮凝劑不僅可應(yīng)用于對懸浮固體的去除，同時也可應(yīng)用于生活污水中COD的去除。因而對微生物絮凝劑的研究具有較強(qiáng)的工程應(yīng)用價值。