賈榮玲

摘 要 為了減少豬傳染性胸膜肺炎給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失，本試驗對某豬場送檢病料采取細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鏡檢、PCR鑒定、動物試驗和藥敏試驗等一系列措施，診斷該病料中的胸膜肺炎放線桿菌為該病的病原。藥敏試驗表明，頭孢噻呋鈉、磺胺嘧啶和恩諾沙星為治療該病的首選藥物，能夠為規(guī)?；i場傳染性胸膜肺炎病的科學(xué)防控和合理用藥提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞 豬傳染性胸膜肺炎；診斷；防治

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.073

豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，2～5月齡的種豬和育肥豬最易感，以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征。河南省周口市某豬場的育肥豬，于2017年3月25日開始發(fā)病，出現(xiàn)死亡病例。病豬癥狀為。1）發(fā)病急。發(fā)病單元豬咳嗽癥狀比例為3%～5%，部分發(fā)病豬死亡前有嘔吐癥狀，然后突然死亡。2）體溫升高。測量6頭，5頭體溫在39.6～39.8 ℃，1頭41.6 ℃。3）病死率高。發(fā)病單元病死率嚴(yán)重的能達(dá)到15%（5%～15%）。4）發(fā)病易反復(fù)。育肥舍53～58單元批次，從2107年4月6日開始發(fā)病，用藥穩(wěn)定后，出現(xiàn)反復(fù)，進(jìn)入后備批次仍然發(fā)病，最終損失106頭。本試驗通過對細(xì)菌的分離鑒定和藥敏實驗，對來自該豬場的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行血清型鑒定和耐藥性測定，為公司對自家苗的研發(fā)、耐藥性監(jiān)測和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料的來源

某豬場送檢的疑似患有豬傳染性胸膜肺炎的肺臟8份，而且是具有該病典型病變特征的肺臟。采樣要求：無菌采集死亡2 h以內(nèi)豬的完整肺臟（連帶氣管），裝入密封的樣品袋中，在4 ℃條件下保存送檢。

1.1.2 實驗動物

健康小白鼠10只。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-系列），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；微型臺式離心機(jī)（TDL-80-2B），上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡（BM XSP-BM-2CE），上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；實體顯微鏡（XTL-6013J4型），蘇州倍特嘉光電科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀（T960），杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；瓊脂糖水平電泳槽（HE-120），天能科學(xué)儀器生產(chǎn)商；恒壓恒流電泳儀（EPS-300），天能科學(xué)儀器生產(chǎn)商；全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（Champ Gel 5000），北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；空氣浴震蕩培養(yǎng)箱（ZHWY-100C），上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GL21M），長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.1.4 主要試劑

腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基，購于廣東微生物科技有限公司；NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），由ROCHE上海如吉生物科技提供；TSA培養(yǎng)基（終濃度50 ?g·mL-1 +10%馬血清），其中TSA培養(yǎng)基來自BD，購自上海樊克生物科技有限公司；馬血清，購自鄭州九龍生物制品有限公司；PCR反應(yīng)試劑、pMD18-Tvector購自大連寶生物工程有限公司；藥敏片由獸醫(yī)研發(fā)中心自制。

1.1.5 引物的設(shè)計與合成

通用引物序列分別為APP-F：GCTCACCAACGTTTGCTCAT、APP-R：GGGGACGTAACTCGGTGATT，擴(kuò)增的片段大小為

377 bp，退火溫度58 ℃，擴(kuò)增基因apxIV，由鄭州賽斯生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將送檢來的病料處理后接種于TSA（終濃度

50 ?g·mL-1+10%馬血清）培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h[1]，因菌株培養(yǎng)特性不一，接種6 h后，每隔2 h觀察

1次，發(fā)現(xiàn)平板長出肉眼可見的菌落后，將其取出，挑取形態(tài)大小疑似APP的菌落，接種到新的TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代純化[2]。

1.2.2 實體顯微鏡下觀察結(jié)果

病原分離后在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)18～24 h，直接將培養(yǎng)皿放在實體顯微鏡下觀察。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡下觀察

用接種環(huán)調(diào)取菌落的純培養(yǎng)物于玻片上，經(jīng)過火焰固定后使用革蘭氏染色方法染色，染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干，然后在光學(xué)顯微鏡下使用100倍油鏡觀察。

1.2.4 PCR鑒定

挑取單個菌落接種于TSA培養(yǎng)基（TSA）中，在

37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)18～24 h。吸取100 ?L菌液于1.5 mL的離心管中，轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，離心3 min，棄上清，加入50 ?L超純水混勻（菌體），在100 ℃的水中煮

10 min。轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1，離心10 min。上清即為所需的DNA模板，在-20 ℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

在PCR管中依次加入PCR Mix 12.5 ?L、雙蒸水

10 ?L、上、下游引物各1 ?L、模板2 ?L，挑配好擴(kuò)增體系，混勻，瞬時離心30 s后放入擴(kuò)增儀中。95 ℃預(yù)變性

5 min，在54 ℃的環(huán)境中退火30 s、在72 ℃的環(huán)境中退火30 s，30次循環(huán)；在72 ℃的環(huán)境中延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（90 V，30 min），電泳結(jié)果用凝膠成像儀拍照觀察。

1.2.5 動物試驗

本次將10只健康小白鼠隨機(jī)分為兩組（每組5只），一組腹腔注射無菌的PPLO液體培養(yǎng)液（空白組），另一組接種培養(yǎng)好的菌液（試驗組）。飼養(yǎng)于動物房中，經(jīng)過24 h后觀察[3]。

1.2.6 藥敏試驗

將含有抗菌藥物（青霉素、頭孢噻呋鈉、慶大霉素、林可霉素、土霉素、磺胺嘧啶、多西環(huán)素、恩諾沙星、阿莫西林、安普霉素、黏菌素、新霉素、氟苯尼考、鏈霉素）的藥敏片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。按胸膜肺炎放線桿菌的抑菌圈直徑大?。╩m）作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)：0 mm<抑菌圈直徑

≤10 mm，低敏；10 mm<抑菌圈直徑≤15 mm，中敏；抑菌圈直徑>15 mm，敏感[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

某豬場分離到的病原菌在TSA培養(yǎng)基中呈圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的半透明小菌落，如圖1所示。

2.2 實體顯微鏡的觀察結(jié)果

在45°折射光下用實體顯微鏡觀察，菌落具有鮮明的金紅帶藍(lán)色熒光，結(jié)構(gòu)細(xì)致，菌落上面似有一層白色云霧，遠(yuǎn)端較濃厚，如圖2所示。用接種絲不容易刮下，對培養(yǎng)基有蝕刻性。

2.3 光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果

病原菌在10×100倍油鏡下，鏡檢為革蘭氏陰性小球桿狀，兩極濃染，無芽孢和鞭毛，有莢膜，如圖3所示。

2.4 PCR檢測結(jié)果

以分離到的6株病原菌核酸提取物為模板，使用豬胸膜肺炎放線桿菌特異性引物App-F/App-R擴(kuò)增出約377 bp的陽性條帶，表明6株細(xì)菌均為豬胸膜肺炎放線桿菌。PCR電泳結(jié)果如圖4所示。

2.5 動物試驗

實驗組的5只小白鼠在注射后24 h內(nèi)全部死亡。解剖死亡小白鼠，發(fā)現(xiàn)肺部嚴(yán)重出血，采取肺臟組織分離培養(yǎng)，經(jīng)染色涂片可見革蘭氏陰性小桿菌，結(jié)果說明肺臟部位分離出來的APP比較純，為致病菌。

2.6 藥敏試驗

極敏感的藥物有頭孢噻呋鈉、磺胺嘧啶和恩諾沙星，不敏感的藥物有青霉素、鏈霉素、阿莫西林和安普霉素，中度敏感的藥物有慶大霉素、林可霉素、土霉素、多西環(huán)素、黏菌素、新霉素、氟苯尼考，結(jié)果見表1。

3 討論與小結(jié)

通過細(xì)菌分離，對分離細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)觀察，以及PCR鑒定，說明該細(xì)菌為胸膜肺炎放線桿菌。通過動物試驗表明該革蘭氏陰性菌致病性非常強(qiáng)，也符合該細(xì)菌的致病特征。通過藥敏試驗及藥物防治，發(fā)現(xiàn)頭孢噻呋鈉、恩諾沙星，磺胺嘧啶有很好的防治效果，氟苯尼考也有一定的療效，但比頭孢噻呋鈉要稍差些，但是在實踐中經(jīng)常使用上述藥物的養(yǎng)殖場，有可能出現(xiàn)與本實驗不相符的現(xiàn)象。

相關(guān)研究表明，豬傳染性胸膜肺炎主要發(fā)生在春季，常發(fā)于在12～25周齡的豬。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，引種日益頻繁，距離也越來越遠(yuǎn)，導(dǎo)致豬場疾病越來越復(fù)雜，病毒、細(xì)菌等多病原混合感染的現(xiàn)象越來越多，給疫病防控工作帶來了很大的難度。預(yù)防和控制豬傳染性胸膜肺炎除了疫苗、抗生素以外，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、實行綜合防控措施提高機(jī)體免疫力是必須與可行的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周信榮，宋德平，彭棋，等.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、毒力基因檢測及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（1）：67-71.

[2] 宋勇.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及NqrA-ELISA方法的建立[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 于桂陽.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏試驗[J].畜禽業(yè)，2008（3）：56-57.

（責(zé)任編輯：趙中正）