孫曉瑩，孟 斐

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110024)

人類進化歷經(jīng)從爬行到直立，由于重力的作用，位于骨盆最低點的盆底組織成為支撐盆腔臟器的重要結(jié)構(gòu)。研究表明，妊娠、絕經(jīng)及產(chǎn)傷會造成盆底肌肉、筋膜、神經(jīng)的過度牽拉受損，導致盆底結(jié)構(gòu)及功能異常，最終出現(xiàn)各種盆底功能障礙性疾病，其中以壓力性尿失禁(SUI)最常見。目前主流觀點認為尿道括約肌功能缺陷是造成SUI的原因之一，因此恢復括約肌的正常結(jié)構(gòu)和功能成為治療的關(guān)鍵[1]。目前用于糾正泌尿功能障礙或修補和重建缺陷膀胱的外科和內(nèi)科治療方法是不理想的，并與明顯的并發(fā)癥有關(guān)[2]，因此探索一種簡單有效的治療方法勢在必行。10年來，干細胞以其強大的再生修復優(yōu)勢出現(xiàn)，如果干細胞移植能修復受損的尿道括約肌，那么SUI女性的漏尿現(xiàn)象將明顯改善。本研究將人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSC)注射到SUI大鼠的膀胱頸(尿道內(nèi)括約肌)和恥尾肌(尿道外括約肌)，通過尿動力學檢測結(jié)果來探討干細胞移植的最佳位點，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物：清潔級成年雌性SD大鼠44只，體重190～220 g；雄性SD大鼠11只，體重220～250 g；由北京華阜康生物科技有限公司提供(實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2009-0004)。

1.1.2 主要試劑盒及儀器：BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；微量輸液泵(史密斯醫(yī)療器械(北京)有限公司)；血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；低溫離心機(eppendorf, centrifuge 5810 R)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；CO2孵箱(Thermo scientific,美國)；Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)、Hyclone 南美胎牛血清及胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 hUCMSC的采集、鑒定培養(yǎng)：提取胎兒側(cè)臍帶5 cm，沖洗干凈后剪碎，組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)貼壁細胞。第3代細胞留置待用。以表面抗原檢測CD34、CD45、CD44、CD105鑒定為間充質(zhì)干細胞。另將部分干細胞繼續(xù)培養(yǎng)傳代，觀察到其擴增能力未受到影響。

1.2.2 動物分組及SUI模型的建立：大鼠4∶1雌雄比例合籠，4周后獲得孕鼠42只，正常產(chǎn)后8只作為正常對照組，34只構(gòu)建SUI模型。造模方法：產(chǎn)后即時腹腔注射20%氯胺酮(10 mL/kg)麻醉，切除雙側(cè)卵巢后F12導尿管插入陰道，固定，使氣囊膨脹后擠壓陰道中下段而不脫出。氣囊注入4 mL水，放平導尿管，遠端連接150 g砝碼牽引4 h后拆除。造模大鼠1只死于麻醉，1只死于感染，最終造模32只。造模成功判定：產(chǎn)后4周，與正常對照組相比，造模大鼠漏尿點壓力(LPP)均低,指壓實驗陽性率均高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明SUI模型構(gòu)建成功。

1.2.3 尿動力學評估及指壓實驗：產(chǎn)后4周(注射前)所有大鼠進行檢測。20%氯胺酮(10 mL/kg)肌注麻醉大鼠，仰臥位固定。下腹縱切口找到膀胱，膀胱頂小切口插入硬膜外導管，深1.5～2 cm，縫合固定，關(guān)腹。將硬膜外導管與BL-420生理記錄儀及微量輸液泵連接，排空氣體，調(diào)節(jié)微泵0.3 mL/min，向膀胱內(nèi)泵入無菌美蘭PBS液，大鼠首次自動排尿時調(diào)停微泵，排尿結(jié)束后尿動力學檢測儀?！?”。同時開啟微泵和生理記錄儀，開始檢測。尿道口出現(xiàn)第1滴尿液時，在生理記錄儀上做以標記，計算當時微泵泵入的液體量并記錄當時的膀胱內(nèi)壓力作為最大膀胱容積(MCC)及漏尿點壓力(LPP)。重復上述操作，每只大鼠檢測2次，取平均值。指壓實驗：待大鼠自動排空膀胱，注入1/2最大膀胱容積的PBS液，避開膀胱區(qū)，以兩指緩慢擠壓大鼠腹部，觀察辨別尿道口有無藍色液體漏出(少量為漏尿，大量為排尿)，記錄各組漏尿陽性大鼠數(shù)量。產(chǎn)后8周(注射后1個月)再次重復上述操作。

1.2.4 細胞移植：hUCMSC濃度1.0×106個/10 μL，每只用量30 μL，細胞數(shù)3.0×106個。移植方法：造模大鼠隨機均分為治療A組(n=8)：消毒外陰，將經(jīng)膀胱底置入的硬膜外導管繼續(xù)向下，經(jīng)過膀胱頸及尿道出尿道外口，上提硬膜外導管尿道外口側(cè)，作為移植注射時尿道解剖位置的確切標記。以距尿道外口1.5 cm、尿道旁1 mm，60 °角進針，深度2 mm，將hUCMSCs注射到中段尿道兩側(cè)的恥尾肌內(nèi)后抽出硬膜外導管，縫合膀胱切口并關(guān)腹；治療B組(n=8)：少許游離膀胱頸部，將hUCMSC分次注射到膀胱頸3點、9點、12點的平滑肌內(nèi),關(guān)腹。對照A組(n=8)、對照B組(n=8)：同法分別注入等量生理鹽水于恥尾肌、膀胱頸。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

與正常對照組相比，造模大鼠LPP均低，指壓實驗陽性率均高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。移植前后治療A組與對照A組比較，MCC差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療A組LPP變化不大，對照A組LPP下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照B組比較：治療B組MCC增加較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LPP升高更明顯，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、2。

表1 hUCMSC恥尾肌注射治療壓力性尿失禁不同時期尿動力學檢測結(jié)果

1)與正常對照組相比，P<0.05；2)與對照A組相比，P<0.05；3)與對照A組相比，P<0.01

表2 hUCMSC膀胱頸注射治療壓力性尿失禁不同時期尿動力學檢測結(jié)果

1)與正常對照組相比，P<0.05；2)與對照B組相比，P<0.05； 3)與對照B組相比，P<0.01

3 討 論

ICS定義規(guī)定：壓力性尿失禁(SUI)指腹壓突然增加導致的尿液不自主流出。該病發(fā)病率高，治療難度大[3]，發(fā)病人群主要為中老年女性，產(chǎn)傷和絕經(jīng)是發(fā)病主要原因。其發(fā)病機制至今未完全明確，大多數(shù)觀點認為尿道周圍支持結(jié)構(gòu)、尿道固有括約肌的缺失以及神經(jīng)功能障礙是其主要原因，肥胖、多產(chǎn)和滯產(chǎn)是其主要危險因素[4]。雖然其診斷以癥狀為主，但尿動力學檢查一定程度上反映了儲尿能力。漏尿點壓力(LPP)測定是一種定量反映尿道閉合功能的方法，可判斷SUI的程度。最大膀胱容積(MCC)是指膀胱充盈期患者不能再延遲必須排尿時的膀胱容量。Bai等[5]研究表明，LPP結(jié)合MCC可以代表動物的儲尿能力。

目前對壓力性尿失禁的治療方法以外科手術(shù)(包括各種補片、吊帶)為主，療效差、并發(fā)癥多，存在復發(fā)后處理困難等問題。而非手術(shù)療法只對輕度患者有效，且短期易復發(fā)?；谝陨先毕荩⑸浏煼ㄒ蚝啽?、安全、微創(chuàng)的特點而逐漸受到重視和歡迎。注射療法是將藥物或化學制劑注射到后尿道或膀胱內(nèi)口周圍粘膜下及肌層中,使尿道腔縮小、變窄和拉長,可不同程度彌補固有括約肌的功能不足,增加尿道阻力,從而改善壓力性尿失禁癥狀。其常用注射材料有硅樹脂顆粒、Teflon(特氟隆)、微球體等。雖近期療效較好,但遠期療效逐漸降低,且有明顯副反應(yīng)，究其原因是缺乏組織再生和整合的特性。干細胞的出現(xiàn)有望為彌補現(xiàn)有療法的局限性提供新的途徑，因為理論上講，注入的細胞可以恢復功能性肌肉細胞，改善患有括約肌相關(guān)失禁的婦女的尿道括約肌活動。用于這種治療目的的干細胞類型有骨髓干細胞、人間充質(zhì)干細胞、人臍血干細胞、人羊膜干細胞、誘導多能干細胞[6]。Blaganje 等[7]曾把肌源性干細胞注射在38例SUI患者的尿道外括約肌上，6個月后隨訪，其中9例患者認為治愈，20 例患者認為癥狀改善。而與肌源性干細胞相比，人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSC)具有來源廣泛、取材方便、易于分離培養(yǎng)、免疫原性低等優(yōu)點，故本實驗選用hUCMSC進行局部注射的方法研究干細胞對壓力性尿失禁的治療作用。

盆底解剖結(jié)構(gòu)復雜，恥尾肌位于盆底中心位置，內(nèi)緣構(gòu)成泌尿生殖裂孔和直腸裂孔，內(nèi)側(cè)尚有部分肌纖維進入尿道及陰道壁，分別圍繞著兩個臟器，前者支持膀胱底肌纖維收縮能提高膀胱，使尿道形成角度，后者收縮，使陰道下段向前與宮頸形成角度，以支持盆腔臟器的正常位置[8]，可見恥尾肌對維持盆底正常結(jié)構(gòu)及功能發(fā)揮著重要的作用。膀胱頸由平滑肌組成，解剖上成“Ω”形，后部肌纖維缺如，有研究發(fā)現(xiàn)，膀胱頸注射填充物可增加尿道閉合壓，提高尿道出口阻力，進而達到控制尿失禁癥狀的目的[9]。

因此本實驗?zāi)M疾病的發(fā)生過程構(gòu)建SUI動物模型，利用“指壓實驗”及LPP、MCC對動物SUI進行診斷及檢驗造模是否成功方法可靠。按照尿道的走行通過將hUCMSCs注射到恥尾肌(橫紋肌)和膀胱頸(平滑肌)的方法研究hUCMSC對SUI雌鼠的治療作用，對研究SUI的發(fā)病機制及選擇最佳移植位點提供實驗依據(jù)。本實驗結(jié)果表明：與正常對照組相比，造模大鼠LPP均低,指壓實驗陽性率均高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明SUI模型構(gòu)建成功。治療A組與對照A組比較：兩組MCC均增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療A組的LPP變化不大，對照A組的LPP下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這說明恥尾肌注射hUCMSC可提高SUI大鼠的尿道閉合壓，但不能改善儲尿能力。與對照B組比較：治療B組的MCC增加較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療B組的LPP升高，對照B組的LPP下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這說明膀胱頸注射hUCMSC可提高SUI大鼠尿道閉合壓的同時改善儲尿能力。是否可以通過同時向恥尾肌和膀胱頸注射hUCMSC累加這種正向作用？療效的發(fā)揮是來自于單純的細胞分化還是細胞的旁分泌作用？亦或是二者兼而有之？尚需進一步研究探尋病理學等方面的證據(jù)。