劉輝琦,舒 雄,孫立新,遇 瓏,孫力超,楊治華,冉宇靚

(1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

肝癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)發(fā)病率位列惡性腫瘤的第5位，死亡率位列第2位[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年全球新發(fā)肝癌病例782,500例，死亡745,500例，其中50%的新發(fā)及死亡病例均在中國[3]。肝癌病例中70%～85%的原發(fā)肝癌是肝細(xì)胞肝癌[4]。目前，主要通過影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行診斷，但發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)展為中晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)。肝癌的治療仍以手術(shù)為主，并配以放療、化療、生物治療等手段以最大可能去除腫瘤細(xì)胞，但治療效果并不明顯，仍有50%～80%的病人因復(fù)發(fā)、耐藥在5年內(nèi)死亡[5]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)或稱為腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells，TICs)是近年研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在的一小群具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，它們與腫瘤的異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為有著密切的關(guān)系[6]。目前已經(jīng)證實(shí)在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在有腫瘤干細(xì)胞，并通過不同表面標(biāo)記物鑒定了不同的肝癌干細(xì)胞亞群[7-8]。對肝癌細(xì)胞中不同干細(xì)胞亞群的表達(dá)及生物學(xué)特性進(jìn)行研究將有助于進(jìn)一步了解肝癌干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，并對臨床個(gè)性化治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

人肝癌MHCC97L細(xì)胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液(美國 Gibco)，胎牛血清(美國Hyclone)，DAPI(美國Sigma)，甲基纖維素(美國Sigma)，表皮生長因子(美國Gibco)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(美國Gibco)、白血病抑制因子(美國Gibco)、無血清細(xì)胞培養(yǎng)因子B27(美國Gibco)，肝素(常州千紅)，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD90抗體(美國eBioscience)、PE標(biāo)記ESA抗體(美國eBioscience)、順鉑(美國Hospira)、CCK8(日本東仁)、Transwell小室(美國millpore)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

人肝癌細(xì)胞系MHCC97L用含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM-H(Dulbecco's Modified Eagle Medium-High Glucose)培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2孵箱中飽和濕度培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞長至90%左右滿時(shí)，0.2%胰酶和0.1%EDTA消化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代，每周傳代2次。37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)5 d，活細(xì)胞流式檢測并分選。無血清球體細(xì)胞培養(yǎng)采用含有表皮生長因子(20 ng/mL)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(20 ng/mL)、白血病抑制因子(10 ng/mL)、肝素(375 U/mL)、無血清細(xì)胞培養(yǎng)因子B27(1∶50)的DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12)無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞表達(dá)比例

無菌條件下消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，加入熒光標(biāo)記ESA和CD90抗體，細(xì)胞孵育密度為1×106/mL，室溫孵育1 h，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用含1%胎牛血清的無菌磷酸鹽緩沖液重懸，過篩網(wǎng)后流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞表達(dá)比例。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分選MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞

無菌環(huán)境中消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，加入熒光標(biāo)記ESA和CD90抗體，細(xì)胞孵育密度為1×106/mL，室溫孵育1 h，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用含1%胎牛血清的無菌磷酸鹽緩沖液重懸，過篩網(wǎng)后流式分選儀分選陽性細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。

1.5 干細(xì)胞成球檢測MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞自我更新能力

將流式分選獲得的ESA+、ESA-、CD90+、CD90-細(xì)胞及親本細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液以500個(gè)/孔接種于含0.8%甲基纖維素的低粘附24孔板，進(jìn)行半固體無血清懸浮培養(yǎng)，7～10 d后顯微鏡下計(jì)成球數(shù)。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞侵襲能力

將流式分選獲得的ESA+、ESA-、CD90+、CD90-細(xì)胞及親本細(xì)胞制備無血清單細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于Transwell小室上室中，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基0.5 mL。置Transwell小室于37 ℃，5%CO2孵箱，飽和濕度培養(yǎng)16 h，取下底膜，洗去未穿透細(xì)胞并用DAPI染色、封片，在熒光顯微鏡下檢測穿膜細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照(200×)，每組細(xì)胞設(shè)一個(gè)平行小室，Image-Pro Plus計(jì)算每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均值計(jì)數(shù)。

1.7 CCK-8法檢測MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞順鉑耐藥性

將流式分選獲得的ESA+、CD90+細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液以3000個(gè)/孔接種于96孔板，37 ℃，5%CO2孵箱，飽和濕度培養(yǎng)24 h后更換含0 μg/mL、0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL不同濃度順鉑的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵箱，飽和濕度培養(yǎng)，3 d換液，7 d后按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8試劑，測定OD450值，用IC50軟件計(jì)算各組IC50值。

1.8 CCK-8法檢測MHCC97L細(xì)胞中ESA+和CD90+細(xì)胞增殖能力

將流式分選獲得的ESA+、CD90+細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液以3000個(gè)/孔接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2孵箱，飽和濕度培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120 h后按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8試劑，測定OD450值，繪制增殖曲線。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ESA+和CD90+細(xì)胞在MHCC97L肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

活細(xì)胞流式免疫熒光術(shù)檢測MHCC97L細(xì)胞系中CD90+、ESA+亞群細(xì)胞表達(dá)比例分別為2.37%，3.70%(圖1)。

圖1 MHCC97L細(xì)胞系中CD90+，ESA+細(xì)胞亞群表達(dá)Fig 1 Expression of CD90+，ESA+ in MHCC97L

2.2 ESA+和CD90+細(xì)胞自我更新能力檢測

親本MHCC97L細(xì)胞甲基纖維素成球率為(16.4±0.8)%，活細(xì)胞流式分選獲得ESA+、ESA-、CD90+、CD90-細(xì)胞成球率分別為(35.6±2.4)%、(9.6±1.4)%、(29.2±1.3)%及(7.4±0.6)%。

ESA+細(xì)胞成球率明顯高于CD90+細(xì)胞(P<0.05)、ESA-及親本細(xì)胞(P<0.01)，CD90+細(xì)胞間成球率明顯高于CD90-細(xì)胞(P<0.01), 親本細(xì)胞成球率則明顯高于ESA-、CD90-細(xì)胞(P<0.01)，但兩組陰性細(xì)胞ESA-、CD90-細(xì)胞間成球率無顯著性差異(P>0.05);ESA+細(xì)胞成球體積明顯大于其他組細(xì)胞(圖2，圖3)。

A：ESA+; B:CD90+ ; C:MHCC97L; D:ESA- ; E:CD90-圖2 不同亞群細(xì)胞成球體積比較(×200)Fig 2 Volume of different sub-population cells(×200)

*** P<0.01;# P<0.05圖3 ESA+、CD90+、ESA-、CD90-細(xì)胞及親本細(xì)胞自我更新能力比較Fig 3 Self-renewal ability of ESA+, CD90+, ESA- , CD90-and parent cells

2.3 ESA+和CD90+細(xì)胞侵襲能力檢測

Transwell侵襲結(jié)果顯示(圖4)，親本MHCC97L細(xì)胞、ESA+、ESA-、CD90+及CD90-侵襲細(xì)胞數(shù)為(185±14.2) 、(282±15.1)、(133±12.4) 、(231±11.8)及(113±10.2)個(gè)。ESA+細(xì)胞侵襲能力是ESA-細(xì)胞的2.12倍(P<0.01)。CD90+細(xì)胞侵襲能力是CD90-細(xì)胞的2.04倍(P<0.01)，并且ESA+細(xì)胞侵襲能力明顯強(qiáng)于CD90+細(xì)胞(P<0.05)，而親本細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于ESA-、CD90-細(xì)胞(P<0.01)，但兩組陰性細(xì)胞ESA-、CD90-細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)，見圖5。

2.4 ESA+細(xì)胞和CD90+細(xì)胞順鉑耐藥性檢測

A:ESA+; B:CD90+; C:MHCC97L; D: ESA-; E:CD90-圖4 不同亞群細(xì)胞侵襲能力比較(×200)Fig 4 Invasion ability of different sub-population cells(×200)

*** P<0.01;# P<0.05圖5 ESA+、ESA-、CD90+、CD90-細(xì)胞及親本細(xì)胞侵襲數(shù)比較Fig 5 Invasion ability of ESA+, CD90+, ESA- , CD90-and parent cells

圖6 ESA+和CD90+細(xì)胞順鉑耐藥Fig 6 Drug-resistance capacity of ESA+ and CD90+ cell

CD90+細(xì)胞的順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)IC50值為0.98 μg/mL，ESA+細(xì)胞IC50值為0.36 μg/mL(圖6)，明顯低于CD90+細(xì)胞。

2.5 ESA+細(xì)胞和CD90+細(xì)胞增殖能力檢測

CCK-8結(jié)果顯示培養(yǎng)24 h后ESA+細(xì)胞增殖速度逐漸快于CD90+細(xì)胞，至120 h后ESA+細(xì)胞增殖速度明顯快于CD90+細(xì)胞(圖7)。

3 討 論

2003年Al-Hajj等[9]首次從實(shí)體瘤乳腺癌細(xì)胞中分離并鑒定出具有干細(xì)胞類似生物學(xué)特性的細(xì)胞群體，從而在實(shí)體瘤中證明了CSCs/TICs的存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CSCs表達(dá)不同的標(biāo)志物[10]。同一標(biāo)志物也可以出現(xiàn)在不同腫瘤細(xì)胞中且表達(dá)比例有所不同，而同一腫瘤細(xì)胞又可表達(dá)多個(gè)CSCs標(biāo)志物。如CD90既是肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物[11-12]，也是胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物[13]，而在肝癌細(xì)胞中有CD90、ESA、CD133等多種不同CSCs標(biāo)志物表達(dá)[14]。目前研究證實(shí)同一腫瘤在不同病人之間表現(xiàn)出不同生物學(xué)性狀，推測可能與不同腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)，同一腫瘤的不同細(xì)胞系也表現(xiàn)出不同生物學(xué)性狀，考慮也與不同干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)。本研究以人肝癌細(xì)胞系MHCC97L為研究對象，活細(xì)胞流式免疫熒光術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中ESA、CD90亞群細(xì)胞均有表達(dá)，但表達(dá)比例有所區(qū)別(3.70% vs. 2.37%)，前者高于后者。進(jìn)而分選兩個(gè)亞群的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)ESA+亞群細(xì)胞的自我更新能力、侵襲能力及增殖能力顯著強(qiáng)于CD90+亞群細(xì)胞。該細(xì)胞系中ESA表達(dá)多于CD90，而ESA+細(xì)胞又表現(xiàn)出了很強(qiáng)的侵襲能力及自我更新能力，因此使得MHCC97L細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)侵襲、轉(zhuǎn)移特性及體內(nèi)成瘤能力，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，提示MHCC97L細(xì)胞系的生物學(xué)特性與其干細(xì)胞亞群組成與分布具有相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果還顯示CD90+細(xì)胞具有強(qiáng)于ESA+細(xì)胞的順鉑耐藥能力，但由于MHCC97L細(xì)胞系中表達(dá)比例低于ESA+細(xì)胞，使得該細(xì)胞系順鉑耐藥能力弱于高表達(dá)CD90的細(xì)胞系。

圖7 ESA+和CD90+細(xì)胞增殖能力Fig 7 Proliferation of ESA+ and CD90+ cells

CD90又稱THY-1，是一種表達(dá)于細(xì)胞表面的糖蛋白分子，屬于免疫球蛋白超家族，與細(xì)胞增殖、壞死、凋亡等相關(guān)[16]。有研究認(rèn)為其能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長,抑制CD90的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及克隆形成能力，因此可作為新的靶向腫瘤干細(xì)胞的靶點(diǎn)[17]，但也有不同觀點(diǎn)認(rèn)為，CD90的表達(dá)反而可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[18]，本研究中CD90+細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于CD90-細(xì)胞，提示在不同腫瘤細(xì)胞中CD90發(fā)揮著不同的效應(yīng)，可能參與了腫瘤異質(zhì)性的形成。研究顯示CD90+細(xì)胞高表達(dá)Oct4和ABCG2，這可能是本研究中CD90+細(xì)胞較ESA+細(xì)胞具有更強(qiáng)順鉑耐藥性的原因，提示CD90高表達(dá)細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的耐藥性，并參與腫瘤耐藥的形成，與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[19]。ESA屬黏附分子家族，是一種鈣非依賴性的上皮細(xì)胞間黏附分子，在上皮癌變過程中發(fā)揮著重要作用，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、分化功能[20]，是公認(rèn)的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物[14,21]。裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ESA+肝癌細(xì)胞成瘤能力明顯強(qiáng)于ESA-肝癌細(xì)胞，并且ESA+肝癌細(xì)胞能夠在軟瓊脂中形成非粘附性的克隆結(jié)構(gòu)[22]，具有明顯強(qiáng)于ESA-細(xì)胞的侵襲性，與研究中ESA+細(xì)胞表現(xiàn)出的強(qiáng)侵襲、增殖能力能相一致。綜上所述，肝癌細(xì)胞系MHCC97L中ESA+細(xì)胞與CD90+細(xì)胞表達(dá)比例不同，二者表現(xiàn)出了不同的生物學(xué)特性，提示腫瘤細(xì)胞中不同干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)可能會(huì)影響到腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。