王傲雪，馬景昕

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 皮膚科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

1 DNA-PKcs

DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(DNA-PK catalytic subunit,DNA-PKcs)，屬于磷酸肌醇-3-激酶相關(guān)蛋白(PI3K-related kinase，PIKK)家族，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PIKK家族有4個(gè)成員：DNA-PKcs、ATM、ATR和mTOR，DNA-PKcs主要與DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接(non-homologous-end-joining,NHEJ)修復(fù)有關(guān)[1](圖1)。DNA-PKcs由prkdc基因編碼，進(jìn)化上保守，幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞都表達(dá)。DNA-PKcs蛋白有4128個(gè)氨基酸殘基，主要含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Ku結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DNA-PKcs主要定位在細(xì)胞核，能使自身和多個(gè)下游靶點(diǎn)如XRCC4和DNA連接酶IV等發(fā)生磷酸化。

DNA損傷不能修復(fù)是腫瘤形成的主要原因。腫瘤中DNA-PKcs相關(guān)的變化主要有prkdc基因突變及DNA-PKcs表達(dá)和活性的改變，而且不同腫瘤組織中其活性的變化也不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤等活性增強(qiáng)，乳腺癌和宮頸癌中活性降低，食道癌和淋巴瘤中活性增強(qiáng)和降低的報(bào)道都有[2-5]。增高的DNA-PKcs活性對(duì)于腫瘤來說是有利的。首先增高的活性使癌前細(xì)胞對(duì)DNA損傷的NHEJ修復(fù)能力提高，細(xì)胞逃脫死亡的命運(yùn)。但這種修復(fù)易出錯(cuò)，引起DNA結(jié)構(gòu)變化，促進(jìn)腫瘤的形成。其次，腫瘤治療中常用的DNA損傷性化療藥物和放療發(fā)揮作用的主要機(jī)制就是造成DNA分子的致死性的雙鏈斷裂，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。而DNA-PKcs活性的增高能在一定程度上抑制細(xì)胞死亡，對(duì)放化療產(chǎn)生耐受。此外，放化療治療后腫瘤組織中存活的細(xì)胞往往是DNA-PKcs活性高的細(xì)胞，它們對(duì)治療不敏感，這也是療效不好和預(yù)后差的原因。因此DNA-PKcs是腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，采用它的抑制劑來增強(qiáng)放化療的效果是一種新的策略。

圖1 DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(fù)過程中DNA-PKcs的作用[1] Fig 1 The role of DNA-PKcs in the non-homologous-end-joining (NHEJ) repair of DNA double-strand breaks (DSBs)[1]

2 DNA-PKcs的抑制劑

2.1 渥曼青霉素(wortmannin)

渥曼青霉素(圖2A)也稱SL-2052或KY-12420，是真菌代謝產(chǎn)生的一種天然類固醇。它可以通透細(xì)胞，與PI3K的110 kD催化亞單位 p110結(jié)合, 不可逆地非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 PI3K的激酶活性，IC50為4.2 nmol/L。較高濃度的渥曼青霉素能抑制DNA-PK的活性(IC50=16 nmol/L)，能與DNA-PKcs蛋白ATP結(jié)合位點(diǎn)中的Lys3751共價(jià)結(jié)合或使Lys802發(fā)生不可逆的烷化，進(jìn)而影響了磷酸根的轉(zhuǎn)移。此外渥曼青霉素也能抑制ATM (IC50=150 nmol/L)和MLCK(IC50=200 nmol/L)等。

博來霉素是腫瘤治療中的常用藥，能引起DNA雙鏈斷裂，渥曼青霉素能顯著增強(qiáng)它致V79中華倉(cāng)鼠細(xì)胞中DNA損傷的作用。倉(cāng)鼠、小鼠、雞和人來源的DNA-PK功能正常的細(xì)胞在渥曼青霉素預(yù)處理后對(duì)電離輻射的敏感性均增高[6]。多種腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性也能被渥曼青霉素上調(diào)。RT112和MGH-U1是兩種對(duì)X射線輻射耐受的膀胱癌細(xì)胞系。前者固有表達(dá)高水平的DNA-PKcs，而后者DNA-PKcs的表達(dá)水平低。渥曼青霉素能上調(diào)前者對(duì)X射線輻射的敏感性，但不改變后一種細(xì)胞的敏感性[7]。因此人腫瘤細(xì)胞中DNA-PKcs表達(dá)的水平可能是一種預(yù)測(cè)DNA-PKcs抑制劑用作放療增敏劑是否有效的指標(biāo)。這兩種細(xì)胞中p53的表達(dá)情況也存在差異，MGH-U1中P53為野生型而RT112中p53存在純合性突變。腫瘤中p53突變是常見的，將P53和DNA-PKcs的表達(dá)情況結(jié)合起來在選擇治療策略時(shí)更有價(jià)值。渥曼青霉素(25 μmol/L)能促進(jìn)1,4苯醌誘導(dǎo)的p53非依賴性的人早幼粒白血病細(xì)胞HL60的凋亡[8]。

A: 渥曼青霉素; B: LY294002; C: NU7026; D: NU7441; E: KU-0060648; F: VX-984; G: M3814;H: CC-115圖2 各種DNA-PKcs抑制劑的結(jié)構(gòu)式Fig 2 Structural formulas of various DNA-PKcs inhibitors

渥曼青霉素的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，溶解度差，體內(nèi)毒性大，對(duì)DNA-PKcs抑制作用缺乏特異性。同時(shí)其分子中存在一個(gè)高反應(yīng)性的C20碳，導(dǎo)致半衰期很短只有10 min。這都限制了它的臨床應(yīng)用。隨著特異性更好、效能更高的DNA-PKcs抑制劑被發(fā)現(xiàn)，渥曼青霉素在醫(yī)學(xué)研究中主要作為PI3K抑制劑應(yīng)用。

2.2 LY294002

LY294002(圖2B)是一種含嗎啉結(jié)構(gòu)化合物，能以一種競(jìng)爭(zhēng)性、可逆性方式與DNA-PKcs的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合。LY294002是非特異性的DNA-PKcs抑制劑(IC50=1.5±0.2 μmol/L)，也能抑制PI3K的激酶活性(IC50=1.4～2.3 μmol/L)，是泛PI3K/mTOR抑制劑。LY294002可以滲透細(xì)胞，在溶液中比渥曼青霉素穩(wěn)定。

體外研究發(fā)現(xiàn)，LY294002能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中明顯的核固縮和減少細(xì)胞質(zhì)體積，顯著抑制結(jié)腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和骨肉瘤細(xì)胞的增殖[9-10]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)它能抑制多種腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)，但這主要是通過抑制PI3K活性施加的。與渥曼青霉素相比，LY294002會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的顯著變化，會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他活性造成不同的影響。如果相關(guān)研究與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度密切相關(guān)，那么應(yīng)用LY294002時(shí)就要更加謹(jǐn)慎。2008年研究人員發(fā)現(xiàn)LY294002能通過抑制DNA-PKcs的活性來使HeLa細(xì)胞對(duì)放療變得敏感[11]。腎細(xì)胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，確診時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不好。研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌組織中DNA-PKcs在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均高于瘤旁組織，腎細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)498和786-9及原代培養(yǎng)的腎細(xì)胞癌細(xì)胞中DNA-PKcs的表達(dá)均高于非癌腎小管上皮HK-2細(xì)胞。LY294002能抑制上述癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而對(duì)HK-2細(xì)胞沒有類似的作用[3]。LY294002單獨(dú)使用能引起人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和MG-63的增殖抑制和凋亡，聯(lián)用時(shí)能上調(diào)這些細(xì)胞對(duì)鹽霉素的敏感性。值得注意的是，LY294002或鹽霉素單獨(dú)使用或聯(lián)用均不影響非腫瘤性成骨細(xì)胞OB-6細(xì)胞的活力[12]。這說明LY294002既有抗腫瘤活性，也有放化療的增敏劑的作用。

LY294002的作用多樣，也能抑制mTOR的活性，影響自噬體的形成和增強(qiáng)櫟精的抗丙肝病毒活性等。LY294002存在清除率高、體內(nèi)毒性大和對(duì)DNA-PKcs選擇性差等問題，研究中不用作DNA-PKcs的抑制劑。但是它在制備更加有效和高選擇性DNA-PKcs抑制劑中起到助力作用。在它的基礎(chǔ)上研究人員找到了NU7026、NU7441和KU0060648等更好的DNA-PKcs抑制劑。

2.3 NU7026

研究人員以LY294002的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，合成了包括NU7026(圖2C)在內(nèi)的11種小分子，NU7026對(duì)DNA-PK的抑制能力約為L(zhǎng)Y294002的6倍(IC50=0.23 μmol/L)。NU7026也稱LY293646，是一種競(jìng)爭(zhēng)性、高選擇性的DNA-PKcs抑制劑，對(duì)ATM和ATR沒有抑制活性。盡管它也能抑制PI3K，但它對(duì)DNA-PKcs的選擇性比PI3K高出60倍。與LY294002不同，它通常被稱作DNA-PKcs特異性的抑制劑。

體外研究表明NU7026能增強(qiáng)電離輻射或DNA損傷藥物的作用。中華倉(cāng)鼠V3細(xì)胞存在DNA-PKcs缺陷，NU7026不能影響電離輻射對(duì)它的損傷。V3YAC細(xì)胞是攜帶人DNA-PKcs基因人工酵母染色體轉(zhuǎn)染的V3細(xì)胞，NU7026能抑制它的生存，增強(qiáng)電離輻射對(duì)它的毒性作用。但NU7026并不影響電離輻射對(duì)V3細(xì)胞的損傷作用。這提示NU7026的作用與DNA-PKcs有關(guān)。在5～50 μmol/L范圍內(nèi)NU7026對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞MRC-5沒有細(xì)胞毒性，而對(duì)肺癌A549細(xì)胞的毒性顯著，說明它是安全和有效的。NU7026預(yù)處理30 min后，X射線或碳離子照射對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用顯著加強(qiáng)[13]。研究人員用γ射線反復(fù)照射歷時(shí)6個(gè)月制備出對(duì)輻射耐受的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549R，采用該細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NU7026能顯著增強(qiáng)γ射線照射的毒性[14]。此外NU7026 能顯著調(diào)高CH1人卵巢癌細(xì)胞的輻射敏感性。上述結(jié)果表明NU7026能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。

多種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用也能被NU7026增強(qiáng)。NU7026能增強(qiáng)伊達(dá)魯比辛、柔紅霉素、阿霉素、依托泊甙、安丫啶和米托蔥醌等的生長(zhǎng)抑制作用，但不能增強(qiáng)喜樹堿或胞嘧啶阿拉伯氨酸的作用。NU7026能增強(qiáng)白血病治療中多種藥物的細(xì)胞毒性，如慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中應(yīng)用的苯丁酸氮芥耐藥性的產(chǎn)生可能與其誘導(dǎo)的DNA-PKcs活性增高和DNA損傷修復(fù)加快有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NU7026會(huì)使CLL細(xì)胞系I83和原代培養(yǎng)的CLL細(xì)胞對(duì)苯丁酸氮芥變得敏感。2017年10月世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，苯丁酸氮芥出現(xiàn)在一類致癌物清單中，因此在腫瘤治療中其用量的增加存在著致癌的風(fēng)險(xiǎn)。NU7026能增強(qiáng)低濃度苯丁酸氮芥的治療作用，同時(shí)又能避免其致癌作用。臨床上多種實(shí)體瘤對(duì)新型的嘧啶類抗腫瘤代謝藥物吉西他濱反應(yīng)良好，但是胰腺癌的反應(yīng)性不理想。有報(bào)道證實(shí)NU7026能顯著上調(diào)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的毒性作用，促進(jìn)其凋亡[15]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中NU7026能顯著提高mTOR抑制劑WAY-600的促進(jìn)凋亡作用[16]。NU7026不會(huì)影響非腫瘤性的成骨細(xì)胞OB-6的活力，但能引起人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和MG-63增殖的抑制和凋亡，同時(shí)NU7026能上調(diào)鹽霉素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用，這表明NU7026的安全性和有效性較好[12]。TRAIL能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，它的小分子抑制劑TIC10能有效殺死各種腫瘤細(xì)胞，是一種新的有前途的抗腫瘤制劑。NU7026對(duì)非癌的HL-7702肝細(xì)胞和原代人成體肝細(xì)胞的增殖沒有影響，但能抑制兩個(gè)肝癌細(xì)胞系(HepG2和Huh-7)及兩種原代肝癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)TIC10對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性[17]。

2005年發(fā)表的小鼠體內(nèi)研究，采用口服、靜脈和腹腔三種方式給予NU7026，藥代動(dòng)力學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)腹腔給藥的方式最好，每天給藥4次，劑量為100 mg/ kg即達(dá)到放療增敏的效果。WAY-600誘導(dǎo)的抗結(jié)腸癌細(xì)胞異種移植物活性在聯(lián)用NU7026的時(shí)候是增強(qiáng)的[16]。肝癌組織中過表達(dá)的DNA-PKcs與肝癌的發(fā)生、不良預(yù)后有關(guān)，可能是預(yù)測(cè)治療反應(yīng)性和生存情況的候選生物標(biāo)記[4]。研究人員將HepG2細(xì)胞注入裸鼠，建立了肝癌異種移植物模型。口服TIC10后，腫瘤在裸鼠中的生長(zhǎng)顯著抑制。腹腔給予NU7026后，TIC10的抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。而單獨(dú)使用Nu7026未見顯著的毒性，只產(chǎn)生了較弱的腫瘤抑制[17]。提示NU7026可以作為放療增敏劑使用，有望成為抗腫瘤治療的一種手段。NU7026的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)決定了其在臨床應(yīng)用中需要處理的時(shí)間過久，有效藥物濃度難以達(dá)到等問題，因此盡管它具有高選擇性和較好的抑制效果，但是要用于臨床必須優(yōu)化。

2.4 NU7441

研究人員采用液相多重平行合成的方法，制備了第6,7和8位的芳香取代物的鉻酮文庫(kù)，然后把它們作為DNA-PKcs抑制劑來進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)NU7441(圖2D)的IC50為14 nmol/L。盡管它也能抑制PI3K的活性，但I(xiàn)C50是5 μmol/L，可見NU7441對(duì)DNA-PKcs的抑制效能和選擇性都很好。

培養(yǎng)的細(xì)胞中，NU7441抑制DNA-PKcs后，阿霉素和電離輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂不能修復(fù)而持續(xù)存在。NU7441能上調(diào)DNA-PKcs為野生型的結(jié)腸癌SW620, LoVo和V3YAC細(xì)胞對(duì)輻射和依托泊苷的敏感性，但在DNA-PKcs存在缺陷的V3細(xì)胞中則沒有這種作用。NU7441的對(duì)放化療的增強(qiáng)作用是由于抑制了DNA-PKcs的活性。兩種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系M059-Fus1和M059J細(xì)胞系中DNA-PKcs功能存在差異，前者功能正常而后者缺陷。NU7441只增強(qiáng)阿霉素和輻射對(duì)前一種細(xì)胞的損傷[18]。NU7441在約為NU7026濃度1/10時(shí)能增強(qiáng)輻射對(duì)在人T淋巴細(xì)胞白血病MOLT-4細(xì)胞的殺傷作用[19]。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、 MDA-MB-231和T47D中DNA-PKcs的活性在輻射后增高，非細(xì)胞毒性濃度NU7441能抑制這種變化，增加細(xì)胞對(duì)電離輻射和阿霉素的敏感性。值得注意的是，代表三陰性乳腺癌的MDA-MB-231細(xì)胞系中NU7441的致敏作用最強(qiáng)，提示NU7441或許能用于改善這種難治性乳腺癌的治療現(xiàn)狀[20]。放療是肝癌治療的主要手段，但是肝癌細(xì)胞修復(fù)放射性損傷的能力很強(qiáng)，因此需要找到能增強(qiáng)放療效果的藥物。NU7441能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并且能進(jìn)一步增強(qiáng)60Coγ射線產(chǎn)生的損傷，可能是肝癌治療中一種潛在的放療增敏劑[21]。碳離子屬于高線性能量傳遞的重離子，劑量控制及射程精確，定位性能好。射程末端的釋放能量集中，對(duì)周圍健康組織損傷小，正逐步替代傳統(tǒng)的光子放療。研究發(fā)現(xiàn)，NU7441增強(qiáng)了A549和H1299肺癌細(xì)胞X射線和碳離子輻射的敏感性，而且對(duì)碳離子的增敏效果更好[22]。此外肺癌中NU7441與拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑氨柔比星和伊立替康聯(lián)用能對(duì)A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。提出NU7441和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑聯(lián)用可能是非小細(xì)胞肺癌的一種有前途的治療手段[23]。鼻咽癌的體外研究也證實(shí)NU7441作為放療敏化劑來應(yīng)用的可能性[24]這些體外研究都提示它有應(yīng)用價(jià)值，需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

3種方式給予小鼠NU7441后對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)盡管腹腔注射的半衰期和清除率與靜脈注射相似，但是生物利用度明顯高于靜脈注射。而口服給藥的生物利用度只有約33%。因此選擇了腹腔注射給藥進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。測(cè)定了SW620異種移植物裸鼠腹腔注射10 mg/kg NU7441后血漿、腫瘤、肝、腎、脾和腦組織中的濃度。發(fā)現(xiàn)受檢組織中NU7441的分布較好，而且在其從血漿清除后組織中的分布仍能維持。重要的是，在給予非毒性劑量NU7441時(shí)，在腫瘤組織中化療致敏所需的濃度能維持至少4 h。NU7441和依托泊苷單用或聯(lián)用都沒有產(chǎn)生明顯的毒性。裸鼠中SW620移植物的體積在約5.6 d的時(shí)候增加了近3倍，依托泊苷單獨(dú)使用或與NU7441聯(lián)用后移植物達(dá)到相同體積約需要8.3 d和11 d?？梢奛U7441使依托泊苷誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)延遲在毒性不增加的情況下增加2倍。人腎細(xì)胞癌組織中DNA-PKcs的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均高于癌旁相對(duì)正常組織。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在口服NU7441(10 mg/kg·d)連續(xù)3周后，人腎細(xì)胞癌細(xì)胞786-0裸鼠異種移植物的生長(zhǎng)顯著受到抑制[3]。

2.5 KU-0060648(KU60648)

KU-0060648(圖2E)的作用最早是在人乳腺癌和結(jié)直腸癌中證實(shí)的。乳腺癌用的是三個(gè)細(xì)胞系：MCF7, T47D和MDA-MB-231。結(jié)腸癌用的是LoVo和SW620兩個(gè)細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)它能抑制上述細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs的自身磷酸化和PI3K介導(dǎo)的AKT磷酸化。因此提出它是DNA-PKcs和PI3K的雙重抑制劑。KU-0060648 表現(xiàn)出較好的口服生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)提高了在精確位點(diǎn)上修飾基因組的能力，產(chǎn)生的DNA剪切主要是通過易出錯(cuò)的NHEJ來修復(fù)的，這限制了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)NU7441和KU-0060648都能減少基因編輯過程中NHEJ的頻率而上調(diào)同源重組的速度，減少后續(xù)在確認(rèn)含有插入的目的基因細(xì)胞時(shí)的工作量[25]。KU-0060648抑制三個(gè)肝癌細(xì)胞系HepG2, Huh-7 和KYN-2的增殖，而對(duì)于非腫瘤性的肝細(xì)胞HL-7702是沒有毒性的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)它對(duì)于DNA-PKcs沉默或突變的HepG2細(xì)胞仍然有細(xì)胞毒性。此時(shí)KU-0060648的作用是不依賴DNA-PKcs的，而是與PI3K-AKT-mTOR的抑制有關(guān)。因此KU-0060648抑制肝癌的作用有DNA-PKcs依賴性和非依賴性的方式兩種，作用更全面，適用的細(xì)胞類型更多。但在DNA-PKcs缺陷性腫瘤中的應(yīng)用要更為穩(wěn)妥[5]。骨肉瘤治療中放療總體是無效的，有學(xué)者提出抑制DNA-PKcs等阻斷DNA修復(fù)或許是可選擇的放療增敏方法。骨肉瘤細(xì)胞DNA-PKcs的蛋白水平比非癌的成骨細(xì)胞高。KU-0060648顯著上調(diào)了143B和U2OS兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系的放射敏感性，此時(shí)細(xì)胞中DNA-PKcs的自我磷酸化顯著下調(diào)，這表明它是能抑制骨肉瘤細(xì)胞中DNA-PKcs的[26]。為評(píng)價(jià)KU-0060648抗結(jié)直腸癌的潛能，采用兩個(gè)細(xì)胞系HCT-116和HT-29及原代培養(yǎng)癌細(xì)胞進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)nM水平的KU-0060648能有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，觸發(fā)凋亡。但是沒有影響正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞[27]。這表明KU0060648對(duì)于骨肉瘤、肝癌和結(jié)直腸癌等來說可能是一種有前景的放療增敏劑。

給予攜帶SW620和MCF7異種移植物的小鼠無毒劑量的KU-0060648后，腫瘤異種移植物中它的濃度可以維持在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)揮化學(xué)增敏作用的濃度至少4 h。KU-0060648單用能延遲MCF7異種移植物的生長(zhǎng)，并且在SW620和MCF7異種移植物中將依托泊苷誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)延遲提高到4.5倍，此時(shí)并沒有將依托泊苷毒性增高到不可接受的水平[28]。在人肝癌組織中DNA-PKcs的表達(dá)是顯著上調(diào)的，腹腔注射KU-0060648能顯著抑制HepG2細(xì)胞移植物在裸鼠中的生長(zhǎng)[5]。

2.6 IC化合物

早在2000-2005年之間，ICOS公司和Array生物學(xué)制藥公司就發(fā)現(xiàn)，一些苯酚相關(guān)類化合物能抑制DNA-PKcs的活性，包括IC60211、IC86621、IC87361和IC486241等(圖3)。IC60211是一種芳基嗎啉，對(duì)激酶有中等強(qiáng)度的抑制作用。在保留芳基嗎啉結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對(duì)它進(jìn)行改良找到了許多DNA-PKcs的選擇性抑制劑，它們?cè)?50 μmol/L的濃度時(shí)都是沒有毒性的。IC86621是IC60211的一個(gè)甲基酮衍生物，雖然不是活性最強(qiáng)的，但適于和易于合成，而且較穩(wěn)定。IC86621結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，它能抑制DNA-PKcs和PI3K的激酶活性。IC87361則是一種嗎啉-類黃酮，對(duì)DNA-PKcs的抑制作用比PI3K的催化亞單位p110β高50倍。要達(dá)到對(duì)放療致敏效果則需要IC87361持續(xù)作用至少4小時(shí)，而且在循環(huán)中它很快被清除，生物利用度低，這是它應(yīng)用于臨床的主要障礙。IC486241能增強(qiáng)阿霉素或順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的毒性[29]。另一項(xiàng)研究中 Davidson等[30]發(fā)現(xiàn)IC486241能與抗結(jié)腸癌藥伊立替康協(xié)同起作用，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

圖3 苯酚相關(guān)類化合物IC60211、IC86621、IC87361和IC486241的結(jié)構(gòu)式Fig 3 The structural formula of phenol-related IC Series

2.7 VX-984

VX-984(圖2F)是一種氘化藥物。氘也稱重氫，是一種氫的穩(wěn)定形態(tài)同位素，具有更強(qiáng)的分子鍵。氘化可以改變藥物的多種特性如形狀、大小、靶標(biāo)結(jié)合力、吸收、分布及毒性。氘化能延長(zhǎng)半衰期，減少服藥次數(shù)或給藥劑量，在保持藥物原有活性和選擇性的同時(shí)使藥物更穩(wěn)定。默克公司從Vertex 制藥公司購(gòu)買了VX-984癌癥項(xiàng)目并在A549肺癌細(xì)胞中的進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)它能抑制DNA-PKcs的活性，而且作用明顯強(qiáng)于其他PI3K家族成員[31]。采用非腫瘤性星形膠質(zhì)細(xì)胞和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，VX-984能抑制DNA-PKcs的活性，這種影響在腫瘤細(xì)胞中顯著強(qiáng)于正常細(xì)胞[32]，因此對(duì)于非腫瘤細(xì)胞的影響小，安全性好。

VX-984的研究主要是在膠質(zhì)瘤中展開。與DNA-PKcs為野生型的M059K膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，DNA-PKcs存在缺陷的M059J膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)輻射更敏感。而導(dǎo)入含有DNA-PKcs基因的8號(hào)染色體能降低M059J的對(duì)輻射的敏感性[33]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)渥曼青霉素和NU7026等都存在藥代動(dòng)力學(xué)不理想、生物利用度低和半衰期短等問題[34]。單獨(dú)給予氘化藥物VX-984不影響DNA-PKcs的活性，但它能顯著抑制X射線照射后兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和NSC11中DNA-PKcs活性的增高，輻射產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂不能被修復(fù)，細(xì)胞死亡增加[35]，提示VX-984是放療的增敏劑。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，X射線照射后U251和NSC11細(xì)胞的小鼠原位腫瘤異種移植物中DNA-PKcs活性增高。如果在照射前半小時(shí)和照射后4 h喂飼溶解在乳化劑5%甲基纖維素中的VX-984后，移植物中DNA-PKcs的磷酸化水平降低，表明VX-984繞過了血腦屏障并且在腦內(nèi)達(dá)到了有效濃度。VX-984單獨(dú)處理負(fù)荷U251或NSC11移植物小鼠并沒有影響總體生存，但VX-984與放療聯(lián)用后放療引起的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用和促小鼠生存的作用都增強(qiáng)了[35]?？梢姡琕X-984優(yōu)先對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮放療增敏劑的作用，具有很好的安全性。VX-984穩(wěn)定性好，并且能通過血腦屏障，是一種很有臨床應(yīng)用前景的DNA-PKcs抑制劑。

2.8 M3814

M3814(圖2G)又稱MSC2490484A，是默克公司自主研發(fā)的一種口服DNA-PKcs抑制劑，不但抑制效能高而且特異性好。為探討M3814在實(shí)體瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病治療中的應(yīng)用，2014年在健康志愿者中進(jìn)行了I期臨床研究。隨后觀察了M3814與致DNA損傷療法如放化療聯(lián)用的效果。2016年默克公司公布了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，M3814在臨床前研究體系中是有活性的，而且在人腫瘤的小鼠模型中能增強(qiáng)輻射對(duì)異種移植物生長(zhǎng)的抑制作用[36-37]。隨后，在2017年公布了它的結(jié)構(gòu)[38]。

體外實(shí)驗(yàn)通常是在約20%氧濃度條件下進(jìn)行的，而正常組織中檢測(cè)到的氧水平大約是3～7%，腫瘤組織中甚至低于2%。因此我們常規(guī)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞所處環(huán)境的氧是偏高的[39]。有研究證實(shí)氧張力降低后放療的殺傷能力也下降[40]，因此進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該是低氧的。為此研究人員采用了低氧的實(shí)驗(yàn)條件，首次發(fā)現(xiàn)M3814與輻射聯(lián)用后能增強(qiáng)輻射對(duì)兩個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和NCI-H1437的殺傷能力[41]。結(jié)果提示DNA-PKcs抑制劑的治療窗口可能比原來預(yù)想的要寬，因?yàn)榇蠖鄶?shù)放療耐受細(xì)胞都處于一種缺氧的小環(huán)境中。此外還發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下M3814對(duì)碳離子作用的增強(qiáng)效果比正常氧條件下增高50%～60%，提示它在缺氧條件下具有更高的效能。通過像M3814這樣的DNA-PKcs抑制來逆轉(zhuǎn)缺氧腫瘤的放療耐受表型是比較有前景的，值得進(jìn)一步臨床前和臨床研究。

2.9 CC-115

CC-115(圖2H)是一種有效的雙重DNA-PKcs和mTOR抑制劑，IC50分別為 13 nM 和 21 nM。它也能抑制PI3K和PIKK家族的多種成員，但抑制能力很弱。體外研究發(fā)現(xiàn)CC-115 能抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖[42]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CC-115 表現(xiàn)出較好的藥代動(dòng)力學(xué)類型，在小鼠、大鼠和狗中口服的生物利用度分別為53%, 76%和100%。在較低的劑量如0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg和1 mg/kg，每天兩次給藥或1 mg/kg每天1次給藥時(shí)，CC-115使前列腺癌體積分別縮小46%, 57%, 66%和57%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)給藥后的1小時(shí)和3小時(shí)即表現(xiàn)出顯著的DNA-PKcs抑制作用，并且在24 h內(nèi)能維持這種作用[42]。除了前列腺癌，CC-115的抗腫瘤作用也在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中展開研究。B細(xì)胞受體通路能指揮B細(xì)胞惡性腫瘤進(jìn)入淋巴組織，使腫瘤細(xì)胞能夠接觸必要的微環(huán)境而得以生存。臨床上使用的伊布替尼和艾代拉里斯都是針對(duì)該通路的靶向藥，后一種已經(jīng)獲FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性CLL、濾泡性淋巴瘤和小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤。但在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，CLL細(xì)胞會(huì)對(duì)它們產(chǎn)生獲得性耐藥，這與DNA損傷修復(fù)有一定關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，CC-115能抑制CLL細(xì)胞中DNA損傷的修復(fù)，并引起休眠的CLL細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴性的死亡。盡管CC-115也能誘導(dǎo)健康B細(xì)胞的死亡，但I(xiàn)C50為0.93 μM，高CLL細(xì)胞的IC50近一倍。在CLL患者中,CC-115減少其淋巴結(jié)病的發(fā)生。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都提示CC-115適合于臨床藥物開發(fā)[43]。

此外，OK-1035、SU11752和NK314也都對(duì)DNA-PKcs具有一定程度的抑制作用，但存在抑制能力弱、藥代動(dòng)力學(xué)類型不理想，作用特異性差等問題，因而相關(guān)研究很少。

3 DNA-PKcs抑制劑的臨床研究

盡管許多分子被證實(shí)能抑制DNA-PKcs活性，目前相關(guān)的臨床研究主要集中在以下四種。一項(xiàng)LY294002的相關(guān)臨床研究是關(guān)于一種水溶性的小分子藥物前體SF1126的。SF1126中含有與含RGD的四肽相結(jié)合的LY294002，能增加腫瘤細(xì)胞中LY294002的濃度，具有潛在的抗腫瘤和抗血管生成的活性。研究是在復(fù)發(fā)和難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中進(jìn)行(NCT02337309)。但已提前終止。VX-984在美國(guó)臨床試驗(yàn)網(wǎng)中也僅有一項(xiàng)研究(NCT02644278)，是在晚期實(shí)體瘤和淋巴瘤中分析VX-984與聚乙二醇脂質(zhì)體阿霉素聯(lián)用的效果已按計(jì)劃完成。M3814的研究有三項(xiàng)。在小細(xì)胞肺癌中與依托泊苷和順鉑聯(lián)用的Ib/II期研究(NCT03116971)因沒有招募足夠的研究對(duì)象和研究?jī)?nèi)容的變化而提前終止。晚期實(shí)體瘤中M3814與分割放療或順鉑聯(lián)用的研究正在招募(NCT02516813)。另一項(xiàng)在晚期實(shí)體瘤和CLL中進(jìn)行的單獨(dú)M3814用藥的I期臨床已于2018年4月按計(jì)劃完成。CC-115相關(guān)臨床研究有三項(xiàng)。正在招募階段的是在去勢(shì)治療耐受的前列腺癌患者中CC-115與恩雜魯胺聯(lián)用的I期臨床試驗(yàn)(NCT02833883)。已完成招募，研究正在進(jìn)行中的是晚期實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤相關(guān)的I期臨床研究(NCT01353625)。還有一項(xiàng)處于II期臨床研究階段(NCT02977780)，主要對(duì)包括CC-115在內(nèi)的幾種可能用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物的安全性和有效性進(jìn)行研究。

4 展 望

放療和DNA損傷藥物在腫瘤治療中十分重要，它們抗癌的機(jī)制都與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生致死性的DNA雙鏈斷裂有關(guān)，這種損傷主要是通過NHEJ來修復(fù)的，因此NHEJ中起關(guān)鍵作用的DNA-PKcs激酶的抑制劑具有增強(qiáng)放化療敏感性的作用。目前已證實(shí)多種小分子能抑制DNA-PKcs活性，但是效能和選擇性各有不同。盡管大量的體外研究證實(shí)DNA-PKcs有很好的抗癌活性和放化療增敏作用，但在進(jìn)入體內(nèi)研究階段出現(xiàn)了藥代動(dòng)力學(xué)不理想、效能低、選擇性差等問題，限制了它們的臨床應(yīng)用。目前一些DNA-PKcs進(jìn)入臨床研究階段，相關(guān)的研究將會(huì)為該類藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，值得關(guān)注。