（浙江省果品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，浙江常山324200）

衢枳殼為蕓香科植物常山胡柚[1-3]（citrus chang shan-huyou）的干燥未成熟果實(shí)，主產(chǎn)浙江，7月果皮尚綠時(shí)采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥制成，有衢枳殼、麩炒衢枳殼、麩衢枳殼、蜜衢枳殼、衢枳殼炭5種飲片。2015版《浙江省中藥炮制規(guī)范》修訂后，將“常山胡柚片”收錄其中，并正式命名為“衢枳殼”。衢枳殼味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)，有理氣寬中、行滯消脹功效，可用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[4-7]。2018年，衢枳殼與鐵皮石斛、靈芝、西紅花等浙江省內(nèi)知名中藥材一并入選新“浙八味”中藥材培育品種名單。

新橙皮苷及柚皮苷是衢枳殼的主要活性成分[8-11]，其含量的高低直接影響衢枳殼的功效，因此測(cè)定衢枳殼中兩種功能成分的含量具有重要意義。

建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定衢枳殼中的新橙皮苷及柚皮苷的方法，對(duì)加強(qiáng)“衢枳殼”有效物質(zhì)研究，保障藥材質(zhì)量安全，規(guī)范市場(chǎng)秩序、促進(jìn)“衢枳殼”產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展、推動(dòng)胡柚產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；Thermo u3000液相色譜儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；VARIAN液相色譜儀：瓦里安公司；HH-4恒溫水浴鍋：江蘇常州國(guó)華電器有限公司；XS105DU分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ2200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；超純水器：杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司。新橙皮苷對(duì)照品（純度：98.76%）、柚皮苷對(duì)照品（99.33%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；衢枳殼：常山縣柚王中藥材有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）、磷酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)；水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（20 ∶80）（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 3.0）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 283 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

1.3.1 新橙皮苷儲(chǔ)備液的配制

精密稱取干燥至恒重的新橙皮苷對(duì)照品19.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.91 mg/mL的新橙皮苷儲(chǔ)備液，2℃～8℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取出放至室溫。

1.3.2 柚皮苷儲(chǔ)備液的配制

精密稱取干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品19.5 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.95 mg/mL的柚皮苷儲(chǔ)備液，2℃～8℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取出放至室溫。

1.3.3 新橙皮苷柚皮苷混合對(duì)照品溶液的配制

精密吸取新橙皮苷儲(chǔ)備液和柚皮苷儲(chǔ)備液各1 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得含新橙皮苷74.6 μg/mL、柚皮苷78.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 供試品溶液的制備[12-16]

取衢枳殼粗粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC圖譜

分別將新橙皮苷儲(chǔ)備液和柚皮苷儲(chǔ)備液以甲醇稀釋至約80 μg/mL進(jìn)樣，得到新橙皮苷色譜圖和柚皮苷色譜圖；將新橙皮苷柚皮苷混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，得到新橙皮苷柚皮苷混標(biāo)色譜圖；供試品按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進(jìn)樣，得到供試品色譜圖。結(jié)果如圖1。

結(jié)果顯示，在此色譜條件下，新橙皮苷與柚皮苷分離較好，專屬性高。

2.2 線性范圍

分別精密吸取新橙皮苷儲(chǔ)備液和柚皮苷儲(chǔ)備液適量，依次配制成含新橙皮苷和柚皮苷分別為①305.6 μg/mL，312.0 μg/mL②152.8 μg/mL，156.0 μg/mL③76.4 μg/mL，78.0 μg/mL④38.2 μg/mL，39.0 μg/mL⑤19.1 μg/mL，19.5 μg/mL 的系列混合對(duì)照品溶液，10 μL進(jìn)樣。相當(dāng)于新橙皮苷和柚皮苷質(zhì)量依次為①3.056 μg，3.12 μg ②1.528 μg，1.560 μg ③0.764 μg，0.780 μg④0.382 μg，0.390 μg ⑤0.191 μg，0.195 μg。檢測(cè)峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別為：Y=19 400X+32 700（R2=0.999 9）和 Y=14 300X+27 200（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，新橙皮苷在 0.191 μg～3.056 μg、柚皮苷在 0.195 μg～3.120 μg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 新橙皮苷與柚皮苷含量測(cè)定的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of neohesperidin and naringin

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后，在室溫25℃下放置，分別按前述色譜條件在0、24、48 h進(jìn)樣，根據(jù)樣品溶液中新橙皮苷和柚皮苷的峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，計(jì)算結(jié)果如表1。

表1 穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability test

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液中新橙皮苷和柚皮苷均在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗(yàn)

將新橙皮苷柚皮苷混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，計(jì)算結(jié)果如表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision test

結(jié)果表明進(jìn)樣精密度RSD均小于3.0%，符合測(cè)定要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

供試品溶液的制備：精密稱取已知含量的供試品0.2 g，精密加入一定量對(duì)照品，使對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分質(zhì)量之比在1∶1左右，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進(jìn)樣。平行制備6份供試品。計(jì)算結(jié)果如表3、表4。

表3 新橙皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery test for neohesperidin

表4 柚皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery test for naringin

回收率/%=（實(shí)測(cè)量-供試品所含被測(cè)成分量）/加入對(duì)照品量×100

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品6份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進(jìn)樣，得到測(cè)定結(jié)果，計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of repeated test

結(jié)果表明，該方法測(cè)定樣品的含量，重復(fù)性好。

2.7 中間精密度

取同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后，于連續(xù)3天內(nèi)分別進(jìn)樣，計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表6。

表6 不同日期中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of inter-assay precision of different days

由3名不同試驗(yàn)人員取同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后進(jìn)樣，計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表7。

表7 不同人員中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of inter-assay precision of different persons

同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理，采用相同的色譜條件，注入不同的液相色譜儀（Waters e2695液相色譜儀、Thermo u3000液相色譜儀、VARIAN液相色譜儀）。計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表8。

表8 不同儀器中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of inter-assay precision of different instruments

結(jié)果顯示，供試品在不同日期內(nèi)處理進(jìn)樣、由不同試驗(yàn)人員進(jìn)行樣品處理或采用不同儀器分析中間精密度均小于3%，方法受隨機(jī)變動(dòng)因素的影響小。

2.8 耐用性

對(duì)不同品牌色譜柱、不同柱溫、不同流速及不同比例流動(dòng)相進(jìn)行考察。色譜柱：采用Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CNW Athena C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個(gè)不同品牌色譜柱進(jìn)樣，理論塔板數(shù)、分離度等均能達(dá)到要求。結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 不同品牌色譜柱考察系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)Table 9 Results of system adaptability test of different chromatographic column

柱溫：設(shè)置25、27、30℃3個(gè)不同柱溫條件進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 不同柱溫考察系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)Table 10 Results of system adaptability test of different column temperature

流速：設(shè)置0.8、1.0、1.2 mL/min 3個(gè)不同流速條件進(jìn)樣，表11。

表11 不同流速考察系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)Table 11 Results of system adaptability test of different flow rate

流動(dòng)相：采用乙腈-水（20∶80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 3.0）、乙腈-水（21 ∶79）（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 3.0）、乙腈-水（19∶81）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）3個(gè)不同比例流動(dòng)相條件進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表12。

表12 不同比例流動(dòng)相考察系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)Table 12 Results of system adaptability test of different mobile phase ratio

結(jié)果顯示，在各考察條件下理論塔板數(shù)、分離度等均能達(dá)到要求，因此方法在所考察因素有小的變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響。綜合考慮，選擇Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱作為此方法常用檢測(cè)色譜柱、流動(dòng)相比例為乙腈-水（20∶80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）、柱溫 25℃、流速 1.0 mL/min。

3 結(jié)論

建立HPLC同時(shí)測(cè)定衢枳殼中新橙皮苷及柚皮苷的測(cè)定方法。橙皮苷及柚皮苷含量為5.6%和7.6%（以干燥品計(jì)），該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于衢枳殼中新橙皮苷及柚皮苷的含量測(cè)定。