王會(huì)全，劉鑫，吳英祥，吳少華，李永裕，*

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350119；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物天然產(chǎn)物研究所，福建福州350002；3.清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心，廣東清遠(yuǎn)511518）

柑橘（Citrus reticulata Banco.），屬蕓香科柑橘亞科植物。柑橘是世界第一大產(chǎn)量水果、第三大國際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品，我國是柑橘重要原產(chǎn)地之一。柑橘在鮮食和生產(chǎn)加工后會(huì)產(chǎn)生大量皮渣，占柑橘總重的30%～50%，僅我國每年就會(huì)產(chǎn)生500×104t以上的皮渣，而80%以上的橘皮未經(jīng)任何處理就被丟棄[1-2]。這不僅造成了極大的資源浪費(fèi)，更給環(huán)境帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)柑橘皮渣的綜合利用已成為柑橘加工業(yè)的重要課題。

柑橘外果皮中富含柑橘精油，柑橘精油無色透明，具有誘人的橘香味，是世界上應(yīng)用最為廣泛的天然香精香料之一[3-4]。研究表明，柑橘皮精油具有抗菌消炎[5]、抗氧化[6]、殺蟲[7]、殺菌[8]、鎮(zhèn)痛[9]、抗癌[10]、使人體中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜[11]、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和消化液分泌[12]等作用。同時(shí)，柑橘皮精油對(duì)于減肥、美容保健[13-14]也有一定的功效。目前，柑橘皮精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[15]、壓榨法[16]、溶劑萃取法[17]、微波輻射法[18]以及超臨界萃取法[19]等。其中，水蒸氣蒸餾法以其設(shè)備簡單、成本低、產(chǎn)量高的優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[3]。但傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法因蒸餾時(shí)間長且溫度高，容易使精油發(fā)生熱分解、水解、氧化、異構(gòu)化等反應(yīng)，導(dǎo)致精油中的有效成分含量下降[17]。而利用超聲波進(jìn)行輔助提取，則可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法的缺點(diǎn)。超聲波是一種頻率高于2×104Hz的聲波，其熱作用、機(jī)械作用、空化作用以及它們的結(jié)合作用可使組織細(xì)胞破壁，從而加速細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)釋放并溶于提取溶劑中。

本文采用超聲波輔助水蒸汽蒸餾法，通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化了柑橘精油的提取工藝，通過單因素和正交試驗(yàn)研究了蒸餾時(shí)間、超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、NaCl濃度和料液比5個(gè)因素對(duì)柑橘皮精油出油率的影響，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技術(shù)鑒定了柑橘皮精油的化學(xué)成分以及抗氧化活性測定。旨在為柑橘皮精油的開發(fā)利用提供參考，研究結(jié)果可為采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法工業(yè)化提取柑橘皮精油提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘果實(shí)：采自福建省泉州市永春縣天馬柑桔場，品種為“永春蘆柑”；NaCl、無水乙醇（分析純）；試驗(yàn)用水：蒸餾水。

1.2 主要儀器

LGJ-25C型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；EL204型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；ZHWY-2008型全溫度恒溫培養(yǎng)震蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；KQ-700DV型恒溫?cái)?shù)控超聲波發(fā)生器：昆山超聲波儀器有限公司；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本EYELA公司；6890N-5973I型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS型色譜柱、毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國 Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

將新鮮的柑橘果實(shí)清洗后，取其果皮，置于室溫下陰干后袋裝于冰箱中冰凍，然后用中草藥粉碎機(jī)將冰凍后且去除冰塊的柑橘果皮磨成粉末，混勻后裝袋儲(chǔ)存于冰箱中備用。

1.3.2 提取方法

稱取新鮮柑橘皮粉末40.00 g，置于錐形瓶中，按各種試驗(yàn)條件（NaCl濃度、料液比）準(zhǔn)備好所需的溶液，從中取80 mL倒入錐形瓶中，在常溫下進(jìn)行不同試驗(yàn)條件（時(shí)間、功率）的超聲波處理，之后用剩余的溶液將超聲波處理后的柑橘皮粉末和溶液全部轉(zhuǎn)移到1 000 mL的圓底燒瓶中，置于水蒸氣蒸餾裝置上根據(jù)不同蒸餾時(shí)間蒸餾提取柑橘皮精油，最后直接讀取精油體積，并分別收集于玻璃試管中，存放于-20℃的冰箱中，待其中的水分完全凍結(jié)后，再將精油倒出分別稱重并收集儲(chǔ)存。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)考察了蒸餾時(shí)間、超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、NaCl濃度和料液比5個(gè)因素對(duì)柑橘皮精油出油率的影響。蒸餾時(shí)間采用 5、10、15、20、25 min 5 個(gè)水平；超聲波處理時(shí)間采用 0、5、10、15、20 min 5 個(gè)水平；超聲波功率采用 190.0、237.5、285.0、332.5、380.0 W 5個(gè)水平；NaCl濃度采用 0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%5 個(gè)水平；料液比采用1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）4個(gè)水平。柑橘皮精油的提取采用1.3.2的方法進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化得到柑橘皮精油提取工藝的最佳參數(shù)。正交試驗(yàn)采用L16（45）表格，試驗(yàn)采用表1的組合進(jìn)行處理，每組處理3次重復(fù)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.3.5 柑橘皮精油提油率計(jì)算

柑橘皮精油出油率/%=蒸餾所得柑橘皮精油質(zhì)量（g）/柑橘皮鮮重（g）× 100

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS v7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，方差分析、顯著性測驗(yàn)采用Tukey法進(jìn)行，以P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異，采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.5 柑橘皮精油成分分析

取柑橘皮樣品5 g，在溫度為50℃、料液比為1∶20（g/mL）、時(shí)間為3 h的條件下進(jìn)行無水乙醇萃取，萃取液經(jīng)過濾后取出，濾渣再重復(fù)萃取一次，合并濾液；濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得精油。精油經(jīng)無水二氯甲烷溶解稀釋后供GC-MS分析用。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS；毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；升溫程序?yàn)椋褐鯗?0℃，保持5 min，以3℃/min升溫至100℃，保持5 min；再以5℃/min升溫至250℃，保持2 min。分流比為5∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描質(zhì)量范圍m/z45～550。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理時(shí)間對(duì)精油出油率的影響

在蒸餾時(shí)間15 min、超聲波功率285.0 W、NaCl濃度2%、料液比1∶6（g/mL）的條件下，進(jìn)行超聲波處理時(shí)間的單因素試驗(yàn)，考察不同超聲波處理時(shí)間對(duì)柑橘皮精油出油率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波處理時(shí)間對(duì)精油出油率的影響結(jié)果Fig.1 The effect of ultrasonic time on essential oil yield from citrus peels

從圖1可以看出，柑橘皮粉末經(jīng)過超聲波處理后，精油出油率均得到顯著提高，其中最高的提高了21.91%；在0 min～10 min范圍內(nèi)，隨著超聲波處理時(shí)間的延長，細(xì)胞壁破碎程度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)的釋放速度隨之加快，精油出油率急劇升高；但超聲波處理時(shí)間超過10 min后，柑橘皮精油的出油率卻呈下降趨勢，這可能是由于超聲波的對(duì)精油有一定的破壞作用和熱效應(yīng)等引起的。所以，本試驗(yàn)中超聲波處理時(shí)間以10 min最佳。

2.2 超聲波功率對(duì)精油出油率的影響

在蒸餾時(shí)間15 min、超聲波處理時(shí)間10 min、NaCl濃度2%、料液比1∶6（g/mL）的條件下，進(jìn)行超聲波功率的單因素試驗(yàn)，考察不同超聲波功率對(duì)柑橘皮精油出油率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波功率對(duì)精油出油率的影響結(jié)果Fig.2 The effect of ultrasonic power on essential oil yield from citrus peels

從圖2可以看出，在190.0 W～285.0 W范圍內(nèi)，隨著超聲波功率的增加，柑橘皮精油的出油率迅速提高，在285.0 W時(shí)達(dá)到最高值2.17%，與其他水平差異顯著；但當(dāng)超聲波功率大于285.0 W時(shí)，精油出油率逐漸下降，這可能是因?yàn)槌暡üβ试酱螽a(chǎn)生的熱效應(yīng)也越強(qiáng)，從而導(dǎo)致部分精油揮發(fā)損失。

2.3 NaCl濃度對(duì)精油出油率的影響

在蒸餾時(shí)間15 min、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波功率 285.0 W、料液比1∶6（g/mL）的條件下，進(jìn)行NaCl濃度的單因素試驗(yàn)，考察不同NaCl濃度對(duì)柑橘皮精油出油率的影響，結(jié)果見圖3。

試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著NaCl濃度的升高，液體中柑橘皮細(xì)胞的滲透壓增大，加速了細(xì)胞的裂解和破碎，柑橘皮精油的出油率也隨之逐漸上升；當(dāng)NaCl濃度為2%時(shí)，精油出油率達(dá)到最大值2.17%，與不添加NaCl的處理相比，精油出油率提高了15.43%；隨著NaCl濃度的進(jìn)一步升高，精油出油率呈下降趨勢。

2.4 料液比對(duì)精油出油率的影響

在蒸餾時(shí)間15 min、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波功率285.0 W、NaCl濃度2%的條件下，進(jìn)行料液比的單因素試驗(yàn)，考察不同料液比對(duì)柑橘皮精油出油率的影響，結(jié)果見圖4。

圖3 NaCL濃度對(duì)精油出油率的影響結(jié)果Fig.3 The effect of NaCl concentration on essential oil yield from citrus peels

如圖4所示，料液比為1∶4（g/mL）時(shí)，柑橘皮精油的出油率顯著低于其他水平；隨著溶劑用量的增加，精油出油率迅速提高到某個(gè)峰值后，繼續(xù)增加溶劑用量精油的出油率反而下降，但下降趨勢趨于平緩，各水平的出油率差異并不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明：溶劑用量過少或過多均不利于精油的提取；溶劑用量過少時(shí)，水散作用不徹底，甚至稍微延長蒸餾時(shí)間就會(huì)導(dǎo)致柑橘皮粉末焦化；而料液比為1∶6（g/mL）時(shí)，其溶劑用量足以使水散作用進(jìn)行徹底，再增加溶劑用量反而不利于精油的提取。因此，本試驗(yàn)中料液比以1∶6（g/mL）最為合適。

圖4 料液比對(duì)精油出油率的影響結(jié)果Fig.4 The effect of solid-liquid radio on essential oil yield from citrus peels

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行蒸餾時(shí)間、超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、NaCl濃度和料液比五因素四水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波輔助提取柑橘皮精油的工藝條件。

2.5.1 正交試驗(yàn)組合對(duì)精油出油率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，正交試驗(yàn)的16種組合中，11號(hào)試驗(yàn)A3B3C1D2E4即蒸餾時(shí)間20 min、超聲波處理時(shí)間15 min、超聲波功率190.0 W、NaCl濃度1.5%和料液比1∶10（g/mL）的條件下，精油出油率最高，達(dá)到2.24%，這個(gè)組合是本試驗(yàn)考察范圍內(nèi)的最佳組合，如表2所示。

表2 不同因素組合對(duì)柑橘皮精油出油率的影響Table 2 Effects of different combinations of factors on essential oil yield from citrus peels

續(xù)表2 不同因素組合對(duì)柑橘皮精油出油率的影響Continue table 2 Effects of different combinations of factors on essential oil yield from citrus peels

2.5.2 5個(gè)因素對(duì)精油出油率的影響程度

從表 2可以看出，極差值 RA＞RE＞RC＞RB＞RD，由此可知，5個(gè)因素對(duì)柑橘皮精油出油率影響的先后順序?yàn)檎麴s時(shí)間＞料液比＞超聲波功率＞超聲波處理時(shí)間＞NaCl濃度。通過方差分析可知，正交試驗(yàn)中的蒸餾時(shí)間、超聲波處理時(shí)間、超聲波功率和料液比4個(gè)因素對(duì)柑橘皮精油出油率的影響較大，均達(dá)到了極顯著的水平，而NaCl濃度對(duì)柑橘皮精油的出油率沒有顯著的影響，如表3所示。

表3 不同因素組合對(duì)柑橘皮精油出油率影響的方差分析Table 3 Anova analysis of effects of different combinations of factors on essential oil yield from citrus peels

2.5.3 五因素出油率趨勢分析柑橘皮精油提取的最佳工藝組合

以柑橘皮精油的出油率為指標(biāo)，繪制5個(gè)因素的水平趨勢圖，如圖5～圖9所示。

柑橘皮精油提取的最佳工藝組合可能是A4B2C1D2E2，即蒸餾時(shí)間25 min、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波功率190.0 W、NaCl濃度1.5%、料液比1 ∶6（g/mL）。

本試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了A4B2C1D2E2組合，其柑橘皮精油的出油率為2.18%，低于A3B3C1D2E4組合。因此，正交試驗(yàn)所得的最佳工藝組合A3B3C1D2E4是本試驗(yàn)考察范圍內(nèi)柑橘皮精油提取的最佳工藝組合，即蒸餾時(shí)間20 min、超聲波處理時(shí)間15 min、超聲波功率190.0 W、NaCl濃度1.5%和料液比 1∶10（g/mL）。

圖5 不同蒸餾時(shí)間出油率趨勢變化圖Fig.5 The level trend of distillation time on essential oil yield

圖6 超聲波處理時(shí)間趨勢變化圖Fig.6 The level trend of ultrasonic time on essential oil yield

圖7 超聲波功率趨勢變化圖Fig.7 The level trend of ultrasonic power on essential oil yield

圖8 NaCl濃度趨勢變化圖Fig.8 The level trend of NaCl concentration on essential oil yield

2.6 超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油的成分分析

超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油GCMS總離子流圖見圖10，柑橘皮精油揮發(fā)物質(zhì)的化學(xué)組成見表4。

圖9 超聲波功率趨勢變化圖Fig.9 The level trend of solid-liquid radio on essential oil yield

圖10 超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油GC-MS總離子流圖Fig.10 Total ion current chromatograms of the essential oil from the citrus peel extracted by water steam distillat

表4 超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油的化學(xué)組成Table 4 Ultrasonic auxiliary steam distillation extraction of citrus peel oil chemical composition

在本試驗(yàn)柑橘皮精油總共檢測出31種物質(zhì)，含量占峰面總面積的98.37%，D-檸檬烯是柑橘皮精油含量最高的一種物質(zhì)，其相對(duì)含量達(dá)到84.22%，其次為萜品烯（6.55%），月桂烯（1.67%），α-蒎烯（1.13%），芳樟醇（0.87%），其他檢測出的成分相對(duì)含量均未達(dá)到1%以上。通過成分歸類分析表明，柑橘皮精油成分主要是單萜物質(zhì)，共11種，占總面積96.07%，其次是為單萜含氧衍生物11種，占1.54%。此外還有少量的脂肪族、倍半萜、倍半萜含氧衍生物等。

續(xù)表4 超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油的化學(xué)組成Continue table 4 Ultrasonic auxiliary steam distillation extraction of citrus peel oil chemical composition

3 結(jié)論與討論

本文采用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化了超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮工藝，柑橘皮精油的最佳提取工藝條件為蒸餾時(shí)間20 min、超聲波處理時(shí)間15 min、超聲波功率 190.0 W、NaCl濃度 1.5%和料液比1∶10（g/mL），在此條件下的柑橘皮精油出油率為2.24%。精油呈現(xiàn)無色透明，雜質(zhì)很少，有柑橘皮的芳香、濃郁，油品高。對(duì)柑橘皮精油測出31個(gè)組分，主要成分為D-檸檬烯，相對(duì)含量達(dá)到了84.22%，這與林夢雅[23]文中提到的柑橘皮精油中含32%～96%的D-檸檬烯相吻合，其次為萜品烯（6.55%），月桂烯（1.67%），α-蒎烯（1.13%），芳樟醇（0.87%）。其中D-檸檬烯含量最高，相對(duì)含量達(dá)到84.22%，這與李翔等[22]的研究成果檸檬烯（56.21%）、月桂烯（5.4%）、芫荽醇（6.1%）等萜類化合物為柑橘皮精油的主要成分大體上相吻合。本文采用超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取柑橘皮精油，可有效提取出除D-檸檬烯外的其它精油組分，盡管試驗(yàn)結(jié)果不能與前人發(fā)表的文章完全一致[16-18]，從提取的效果上來看優(yōu)化后的提取檸檬烯的效果較為明顯好于前人，這與試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和技術(shù)提升有密切的關(guān)系。

當(dāng)前柑橘產(chǎn)業(yè)正面臨前所未有的災(zāi)難，其主要是由病害黃龍病和蟲害桔小實(shí)蠅造成的，怎樣增加柑橘的深加工水平，增加農(nóng)民收益是目前柑橘發(fā)展一項(xiàng)重要內(nèi)容。而充分利用柑橘皮，對(duì)已經(jīng)遭受桔小實(shí)蠅影響的柑橘進(jìn)行收購提煉精油，有益于增加柑橘的高附加值。D-檸檬烯在許多植物精油中都存在，據(jù)相關(guān)報(bào)道檸檬烯對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等具有較好的抑制效果，尤其對(duì)啤酒酵母和面包酵母抑制效果更佳，具有廣譜抗菌性。在食品工業(yè)中，檸檬烯可作為天然防腐劑；在香料工業(yè)中，可用于化妝品、皂用及日用化學(xué)品的香精，都具有很好的效果。這些都顯示了柑橘皮精油具有潛在巨大的研究前景和應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。