劉 洪，顏成東，蔣尚飛

(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城 224005)

甲狀旁腺素相關(guān)肽(parathyroid hormone related peptide，PTHrP)的結(jié)構(gòu)和作用均和甲狀旁腺素(PTH)相類似[1]。PTHrP和PTH有相同的受體，并且PTHrP通過自分泌/旁分泌方式發(fā)揮多種生理功能[2]。PTHrP的N-末端(1～36)和PTH的功能基本相同；而PTHrP核定位序列(87～106)和C-末端共同通過細(xì)胞內(nèi)分泌的方式達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能[3]。為了研究PTHrP核定位序列及C末端的功能，利用基因工程在PTHrP的第84位氨基酸序列后敲入一個(gè)終止密碼TGA，制備了不表達(dá)PTHrP核定位序列及C-末端的小鼠模型，稱為PTHrP Knock-in(PTHrP KI)小鼠。這種小鼠的表型有生存時(shí)間變短，以及骨骼、腦組織和皮膚發(fā)育不良等表現(xiàn)[4]。為了研究PTHrP核定位序列及C末端缺失對(duì)小鼠下頜磨牙發(fā)育是否存在影響，本研究利用出生后2周的PTHrP KI小鼠和野生型小鼠的下頜磨牙進(jìn)行比較，研究PTHrP核定位序列及C末端缺失對(duì)小鼠下頜磨牙發(fā)育和礦化的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用雄性PTHrP KI雜合子小鼠和雌性PTHrP KI雜合子小鼠交配(小鼠購自江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，獲得同窩的野生型(wild type，WT)小鼠和PTHrP KI純合子(PTHrP KI)仔鼠。仔鼠由母鼠喂養(yǎng)，母鼠使用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。待小鼠生長(zhǎng)至2周后取材，WT小鼠(WT組)和PTHrP KI小鼠(PTHrP KI組)分別取10只進(jìn)行后續(xù)的影像學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物基因型鑒定 小鼠出生后剪取鼠尾，使用蛋白酶K進(jìn)行消化，提取DNA后利用PCR進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物使用BstEⅡ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)后行瓊脂糖凝膠電泳，WT小鼠條帶為424 bp，PTHrP KI小鼠條帶為258 bp和166 bp[5]。

1.2.2取材 WT小鼠和PTHrP KI小鼠生長(zhǎng)至2周后，頸椎脫臼處死，解剖分離左右兩側(cè)下頜骨，使用免疫電鏡固定液固定后行CT掃描，使用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣后石蠟包埋，切片。

1.2.3影像學(xué)檢查 使用SkyScan 1072 scanner CT掃描儀對(duì)WT小鼠和PTHrP KI小鼠下頜骨進(jìn)行掃描，通過CT檢查觀察，沿著下頜第一磨牙近中根管方向進(jìn)行三維重建。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟切片分別使用100%、75%和50%乙醇進(jìn)行脫蠟，蘇木精染色8 min，伊紅染色2 min，分別使用50%、75%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察放大100倍HE染色切片，測(cè)量?jī)煞N小鼠下頜第一磨牙長(zhǎng)度，放大400倍HE染色切片測(cè)量?jī)煞N小鼠的下頜第一磨牙前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)的比例。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢查 石蠟切片使用牛睪丸透明質(zhì)酸酶消化，Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)一抗為免抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruiz公司生產(chǎn))，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruiz公司生產(chǎn))，使用生物素-親和素-橋聯(lián)堿性磷酸酶酶標(biāo)法(ABC-AP，美國(guó)Vector公司生產(chǎn))孵育，堿性磷酸酶染色液染色后使用甲基綠復(fù)染。牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)、Ki-67和 p27一抗均為兔抗多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruiz公司生產(chǎn))，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruiz公司生產(chǎn))，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(Elite-AP，美國(guó)Vector公司生產(chǎn))孵育后使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液染色，DSP使用蘇木精復(fù)染。

2 結(jié) 果

2.1影像學(xué)檢查 Micro-CT掃描三維重建結(jié)果顯示，PTHrP KI組小鼠的下頜第一磨牙牙根長(zhǎng)度明顯小于WT組小鼠，見圖1。

2.2HE染色 WT組小鼠的下頜第一磨牙長(zhǎng)度較PTHrP KI組小鼠長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.109，P<0.01)；WT組小鼠的前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)比例小于PTHrP KI組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.178，P<0.01)，見圖2、表1。

A：WT組小鼠下頜骨(×100)；B：PTHrP KI組小鼠下頜骨(×100)；C：WT組小鼠下頜第一磨牙牙頸部(×400)；D：PTHrP KI組小鼠下頜第一磨牙牙頸部(×400)圖2 兩組小鼠HE染色

表1 兩組小鼠下頜第一磨牙長(zhǎng)度和前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)比例比較

表2 兩組小鼠下頜第一磨牙Collagen-Ⅰ、DSP、Ki-67和p27陽性表達(dá)比較

2.3免疫組織化學(xué)染色 WT組小鼠Collagen-Ⅰ占下頜第一磨牙陽性比例、Ki-67陽性細(xì)胞比例和DSP占牙本質(zhì)陽性比例均高于PTHrP KI組小鼠，p27陽性細(xì)胞比例低于PTHrP KI組小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表2。

A、B：Collagen-Ⅰ(×100);C、D：DSP(×400);E、F：p27(×400);G、H:Ki-67(×400)圖3 兩組小鼠磨牙中Collagen-I、DSP、Ki-67和p27陽性表達(dá)

3 討 論

在牙齒的發(fā)育、萌出和礦化過程中，多種鈣、磷調(diào)節(jié)激素如1,25(OH)2D3[6]、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23(fibroblast growth factor-23，F(xiàn)GF-23)[7]的缺乏或者過表達(dá)都有可能干擾牙齒細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和礦化，最終導(dǎo)致牙齒發(fā)育異常。

本研究結(jié)果顯示，CT掃描后重建結(jié)果表明與WT小鼠比較，PTHrP KI小鼠下頜第一磨牙的長(zhǎng)度縮短；通過對(duì)下頜第一磨牙進(jìn)行HE染色、分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTHrP KI小鼠下頜第一磨牙的長(zhǎng)度明顯縮短；進(jìn)一步分析表明，PTHrP KI小鼠下頜第一磨牙前期牙本質(zhì)的比例明顯高于WT小鼠。在牙本質(zhì)的發(fā)育階段，成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成前期牙本質(zhì)，前期牙本質(zhì)在不斷礦化之后形成牙本質(zhì)，如果前期牙本質(zhì)的礦化過程受阻，則前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)的比例就會(huì)明顯升高[6]。本研究HE染色結(jié)果表明，小鼠PTHrP核定位序列和C末端缺失可能導(dǎo)致了牙本質(zhì)基質(zhì)生成減少和礦化的異常。

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠的Collagen-Ⅰ在磨牙區(qū)的陽性表達(dá)比例明顯小于WT小鼠。Collagen-Ⅰ是成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并且在牙本質(zhì)礦化過程中能夠作為羥基磷灰石沉積的框架[8]。研究結(jié)果表明，小鼠PTHrP核定位序列和C-末端缺失導(dǎo)致了小鼠磨牙細(xì)胞外基質(zhì)形成減少。PTHrP KI小鼠下頜第一磨牙牙本質(zhì)中DSP的陽性面積明顯小于WT小鼠，DSP是由牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行編輯合成，不僅能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，而且還能夠在牙本質(zhì)的礦化過程中調(diào)節(jié)羥基磷灰石晶體的形成，而且能夠促進(jìn)前期牙本質(zhì)形成牙本質(zhì)，因此，DSP也被認(rèn)為是牙本質(zhì)礦化的重要指標(biāo)[9]。本研究結(jié)果表明，PTHrP核定位序列和C末端缺失導(dǎo)致了DSP合成減少，進(jìn)而阻止了前期牙本質(zhì)的礦化過程。免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠下頜第一磨牙牙髓和上皮根鞘處p27的陽性細(xì)胞比例明顯增加，而Ki-67的陽性細(xì)胞比例則有所降低。在有絲分裂期，Ki-67表達(dá)水平最高，因此可以把Ki-67作為細(xì)胞增殖狀態(tài)重要細(xì)胞因子[10-11]。p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI)家族成員，CDKI能夠和細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻斷細(xì)胞的增殖過程[12]。而p27是PTHrP的下游靶標(biāo)，當(dāng)PTHrP KI小鼠體內(nèi)表達(dá)PTHrP蛋白中核定位序列和C-末端缺失，導(dǎo)致殘缺的PTHrP蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞核，喪失了對(duì)p27的調(diào)控抑制作用，從而導(dǎo)致了p27表達(dá)水平上調(diào)[13]。

PTHrP發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用是通過其蛋白的NLS和C-末端以細(xì)胞內(nèi)分泌的方式進(jìn)入細(xì)胞核后實(shí)現(xiàn)的，而PTHrP KI小鼠體內(nèi)的PTHrP蛋白缺失了核定位序列和C-末端。體外研究表明，PTHrP缺失核定位序列和C-末端片段能調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而使得細(xì)胞凋亡明顯增加[14]。研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP在牙齒間充質(zhì)細(xì)胞、牙乳頭、上皮根鞘等處均有表達(dá)[15]，而PTHrP KI小鼠分泌的PTHrP蛋白因?yàn)槿笔Ш硕ㄎ恍蛄泻虲-末端，失去了通過細(xì)胞內(nèi)分泌方式進(jìn)入細(xì)胞核來發(fā)揮促細(xì)胞增殖的作用，導(dǎo)致牙髓p27蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Ki-67蛋白表達(dá)水平下降，導(dǎo)致牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的凋亡增加和向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化減少，進(jìn)而導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌減少，并且進(jìn)一步影響了牙本質(zhì)的生成和礦化；此外，牙根的形成和上皮根鞘密切相關(guān)[16-17]，同樣，PTHrP蛋白核定位序列和C-末端缺失還可能導(dǎo)致了小鼠磨牙上皮根鞘處的細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致了PTHrP KI小鼠磨牙牙根發(fā)育障礙。

綜上所述，PTHrP核定位序列和C-末端缺失導(dǎo)致小鼠磨牙細(xì)胞增殖受阻，牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)分泌減少，礦化障礙，最終導(dǎo)致了小鼠磨牙的發(fā)育異常。