鄧子文，黃 東，蔡 慧，徐世明

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東湛江 524023；2.廣東省第二人民醫(yī)院創(chuàng)傷顯微外科，廣州 510317)

骨移植是臨床上最常見的移植類手術(shù)之一，全球每年有超過200萬患者進(jìn)行骨移植手術(shù)，在美國選用同種異體骨作為骨移植材料占總骨移植數(shù)量的1/3[1-2]。但是，大段同種異體骨移植后因感染、再次骨折、骨不連等并發(fā)癥導(dǎo)致的遠(yuǎn)期失敗率高達(dá)25%[3-4]。如何促進(jìn)大段同種異體骨的骨誘導(dǎo)能力，降低移植后的并發(fā)癥成為研究熱點。FTY720是一種新型免疫抑制劑，在體內(nèi)活性成分為FTY720-P，除能有效抑制免疫反應(yīng)外，還具有一定的成骨作用，但機制尚不清楚[5-6]。本文擬通過動物實驗探索FTY720-P聯(lián)合同種異體骨修復(fù)骨缺損的效果，為該藥在臨床上的應(yīng)用及后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 普通級成年新西蘭大白兔40只，雄性，體質(zhì)量2～3 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2主要儀器與試劑 FTY720-P(美國Cayman公司)，兔骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，電子萬能試驗機(上海企想檢測儀器有限公司)，BX43型顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1同種異體骨的制備 隨機選取4只新西蘭大白兔，采用耳緣靜脈注射空氣法處死，無菌條件下完整取出四肢長骨，用微型多功能電鋸將取下的長骨鋸成長約15 mm的骨段，1∶1甲醇和氯仿12 h脫脂，30%過氧化氫(H2O2)12 h脫蛋白，0.6 mmol/L HCl 5 min脫鈣[7]后獨立包裝，以25 kGy60Co輻照滅菌12 h，然后將同種異體骨放入-80 ℃深低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2同種異體骨移植 首先按說明書將FTY720-P配制成濃度為1 mg/mL的溶液備用。受試動物用戊巴比妥聯(lián)合846合劑麻醉，右前肢橈骨中段充分暴露，用微型多功能電鋸在橈骨中段建立15 mm長骨缺損模型,然后將動物隨機分為A、B、C 3組，每組12只。其中A組移植用1 mg/mL FTY720-P溶液浸泡30 min后的同種異體骨，B組移植未做處理的同種異體骨，C組移植自體橈骨。

1.2.3影像學(xué)檢查 術(shù)后4、8、12周各組隨機抽取6只動物經(jīng)耳緣靜脈戊巴比妥麻醉后常規(guī)攝X線片，觀察骨移植區(qū)骨痂、新骨形成情況，并采用Lane-Sandhu法[8]進(jìn)行影像學(xué)評分。

1.2.4組織學(xué)與免疫組織化學(xué)檢測 術(shù)后4、8、12周各組隨機抽取3只動物空氣法處死，完整取出右前肢橈骨，4%多聚甲醛固定24 h，乙二胺四乙酸(EDTA)法脫鈣1～3周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿移植骨縱軸縱向行4 μm厚度組織切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色。BMP-2抗體工作濃度1∶200，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)方法顯色，棕色判為陽性，對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替Ⅰ抗。

1.2.5生物力學(xué)檢測 術(shù)后12周各組剩余的6只動物采用耳緣靜脈注射空氣法處死，然后完整取出右前肢橈骨進(jìn)行三點彎曲試驗。實驗前先對標(biāo)本移植區(qū)進(jìn)行人工彎曲，若移植區(qū)不穩(wěn)定或極易發(fā)生彎曲則判定為修復(fù)失敗，反之繼續(xù)行三點彎曲實驗。將標(biāo)本放于儀器上，間距30 mm，在移植骨中點位置向下加載負(fù)荷，加載速度10 mm/min，記錄最大彎曲強度及位移。

2 結(jié) 果

2.1X線片觀察和Lane-Sandhu評分 骨移植后第4周，A組移植骨與宿主骨交界處近端觀察到骨痂形成；第8周，A組移植骨與宿主骨交界處近遠(yuǎn)端均觀察到骨痂形成，且骨痂形成的量大于B組；第12周，A、C組移植骨與宿主骨間已完全融合，B組則尚未完全達(dá)到融合，見圖1。在骨移植后第4、8、12周A、C組Lane-Sandhu評分均高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A、C組術(shù)后各時間點Lane-Sandhu評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.2組織學(xué)觀察 術(shù)后4周，A組橈骨斷端及移植骨周圍可見少量炎性細(xì)胞，大量骨痂形成，主要成分為纖維組織及軟骨細(xì)胞、局部見編織骨形成、伴有少量骨髓腔，纖維組織內(nèi)可見較多破骨細(xì)胞及碎骨片(圖3A)；B組橈骨斷端周圍較多炎性細(xì)胞聚集及大量纖維組織增生，局部見少量軟骨細(xì)胞及少量編織骨(圖3D)；C組橈骨斷端及移植骨周圍見大量骨性骨痂，植入體內(nèi)可見少量血管(圖3G)。術(shù)后8周，A組橈骨斷端見少量軟骨細(xì)胞及大量編織骨，移植骨內(nèi)見少量血管生成，骨髓腔內(nèi)形成骨小梁、可見少量骨髓(圖3B)；B組移植骨與周圍編織骨部分融合，融合部位植入體內(nèi)可見極少量小血管(圖3E)；C組橈骨斷端形成大量板層骨，與移植骨融合，骨髓腔再通(圖3H)。術(shù)后12周，A組橈骨斷端可見大量板層骨生成，移植骨與新生的板層骨融合(圖3C)；B組移植骨與新生骨組織基本融合，周圍見少量板層骨(圖3F)；C組移植骨骨皮質(zhì)重塑，但較正常骨皮質(zhì)薄(圖3I)。

2.3BMP-2免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后4周各組中BMP-2均可見陽性表達(dá)，主要表達(dá)于新生成骨質(zhì)的骨陷窩、新生骨附近成骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及纖維性骨痂基質(zhì)內(nèi)，見圖4。

圖1 3組骨移植后各時間點X線片

*：P<0.05，與B組比較圖2 3組術(shù)后各時間點Lane-sandhu評分(n=6)

A～C：A組術(shù)后4、8、12周；D～F：B組術(shù)后4、8、12周；G～I(xiàn)：C組術(shù)后4、8、12周圖3 3組術(shù)后各時間點組織學(xué)檢查(HE×40)

2.4生物力學(xué)檢測 人工彎曲實驗結(jié)果顯示A組、C組移植骨與宿主骨完全融合，B組部分標(biāo)本移植骨與宿主骨界限仍較清晰。三點彎曲實驗顯示，A組修復(fù)后的橈骨最大彎曲強度大于B組(P<0.05)；與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

*：P<0.05，與B組比較；intact：對側(cè)正常橈骨圖5 三點彎曲實驗測試術(shù)后12周3組骨移植修復(fù)骨缺損后橈骨的最大彎曲強度

3 討 論

大段同種異體骨常用于嚴(yán)重創(chuàng)傷、骨腫瘤切除后的保肢治療，但大段同種異體骨移植后移植區(qū)域周圍血供不足及遠(yuǎn)期并發(fā)癥如移植骨與宿主骨骨不連(10%～30%)、持續(xù)感染(6%～13%)、二次骨折(10%～30%)[9-11]等的發(fā)生卻令臨床醫(yī)生不盡滿意，往往導(dǎo)致患者功能差，甚至手術(shù)失敗。許多學(xué)者通過在同種異體骨上復(fù)合自體干細(xì)胞[12]、重組蛋白[13]、富血小板血漿[14]、基因治療[15]等方法來促進(jìn)大段同種異體骨移植周圍微血管網(wǎng)的再生及異體骨與宿主骨的融合，取得一定效果。近期研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)結(jié)構(gòu)類似物FTY720可促進(jìn)同種異體骨移植后移植骨與宿主骨之間的融合。

S1P是一類真核生物體內(nèi)天然存在的具有生物活性的細(xì)胞膜鞘類脂質(zhì)的代謝中間產(chǎn)物[16]，由鞘氨醇在鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPHK)的磷酸化作用下形成，通過與S1P受體(sphingosine-1-phosphate receptor，S1PRs)結(jié)合調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡、定位[17]。鞘氨醇結(jié)構(gòu)類似物FTY720是一種新型免疫抑制劑，體內(nèi)經(jīng)SPHK2磷酸化為活性成分FTY720-P，可非選擇性結(jié)合S1PRs從而發(fā)揮生物效應(yīng)[18-19]?，F(xiàn)有研究表明，F(xiàn)TY720/FTY720-P可趨化破骨細(xì)胞由骨表面向外周血遷移，抑制破骨細(xì)胞的形成[20-21]。同時，在切除卵巢的小鼠中，F(xiàn)TY720可促進(jìn)其骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，F(xiàn)TY720顯著增加成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、Runx2及Sp7的表達(dá)[22]。分子細(xì)胞的研究說明，F(xiàn)TY720/FTY720-P對骨代謝有著重要的影響。本研究在利用FTY720-P聯(lián)合同種異體骨修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的動物實驗中觀察到，術(shù)后12周運用FTY720-P的A組成功修復(fù)橈骨大段骨缺損，三點彎曲實驗中A組修復(fù)后的橈骨生物力學(xué)強度明顯大于單純同種異體骨修復(fù)后的橈骨。術(shù)后4、8、12周A組骨痂形成的量、Lane-Sandhu評分均明顯高于單純同種異體骨修復(fù)的橈骨，可達(dá)到類似自體骨的修復(fù)效果。說明FTY720-P可促進(jìn)同種異體骨與宿主骨的融合，增強其生物力學(xué)強度。

研究發(fā)現(xiàn)，通過連續(xù)皮下注射FTY720并不能促進(jìn)鼠股骨骨折的愈合及骨缺損的修復(fù)[23]。但將FTY720以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLAGA)為支架復(fù)合在同種異體骨上修復(fù)鼠顱骨、脛骨骨缺損的實驗中，發(fā)現(xiàn)FTY720可明顯促進(jìn)骨形成[24-26]。復(fù)合在同種異體骨上的FTY720隨著PLAGA的降解持續(xù)在骨缺損周圍釋放，使得局部FTY720的濃度維持在一定范圍，可促進(jìn)骨缺損周圍微血管網(wǎng)的形成及小動脈的擴張，增加骨缺損區(qū)域血供，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[24-26]。本研究將FTY720-P通過浸泡的方法復(fù)合在同種異體骨上，增加異體骨局部FTY720-P濃度，在術(shù)后8周A組HE染色結(jié)果觀察到異體骨內(nèi)新生血管形成，B組僅見極少量血管。說明經(jīng)FTY720-P浸泡后的同種異體骨移植后對其局部血管形成同樣有一定促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)異體骨與宿主骨的融合。

同種異體骨移植后的免疫排斥反應(yīng)同樣影響其與宿主骨間的融合。而FTY720作為一種免疫抑制劑，可抑制淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)釋放入外周血，并在臨床上已應(yīng)用于治療多發(fā)性硬化癥[18-19]。骨折愈合早期特征是免疫細(xì)胞侵入局部血腫的炎性反應(yīng)階段[27]。同種異體骨局部釋放FTY720可明顯減少移植區(qū)CD45+白細(xì)胞數(shù)量[25]。本實驗中觀察到術(shù)后4周B組移植骨周圍見較多炎性細(xì)胞，而A組炎性細(xì)胞少見，表明FTY720-P對局部炎性反應(yīng)有抑制作用，筆者推測這一作用可能是FTY720-P促進(jìn)異體骨與宿主骨融合的機制之一。

綜上所述，移植經(jīng)FTY720-P浸泡后的同種異體骨可促進(jìn)異體骨局部血管形成、降低局部炎性反應(yīng)，增強異體骨生物力學(xué)強度，成功修復(fù)大段骨缺損，可達(dá)到自體骨修復(fù)骨缺損的效果，為臨床降低大段同種異體骨移植后遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生提供一種新的治療決策。但浸泡后FTY720-P的復(fù)合效率及作用時間的確定還需進(jìn)一步研究。