阮文強，陳新諾，任玉鵬，覃思楠，湯 承,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2. 國家民族事務委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團隊，成都 610041)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起犢牛腹瀉的重要病原，該病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員。BVDV在世界范圍內廣泛存在，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟損失[1]。該病毒不僅能感染牛，引起犢牛發(fā)生腹瀉等癥狀，還可以感染各種動物，如豬、綿羊、山羊和野生有蹄類動物[2-3]。根據(jù)BVDV 5′UTR、Npro等基因序列的差異，可將BVDV分為2種基因型，即BVDV1和BVDV2型，從生物角度每個基因型可分為致細胞病變和不致細胞病變型。BVDV感染后可表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為發(fā)燒、腹瀉、持續(xù)性感染、免疫抑制性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、生殖障礙等[4-6]，出血性綜合征則表現(xiàn)為出血、血小板減少和黏膜病等[7-9]。有研究顯示，急性BVDV感染后主要表現(xiàn)為白細胞減少和血小板減少等癥狀[10-12]。這些血液學方面的異?？赡軞w因于BVDV的感染和復制所致[12-13]。BVDV誘導血小板減少癥的發(fā)病機制尚不清楚。然而，有報道稱是因為感染BVDV后加速了血小板的破壞速率或減少了血小板的生成速率[14-15]。另外有研究顯示以BALB/c小鼠為試驗動物，通過組織病理變化，免疫組化等試驗表明肺是BVDV病原的主要復制器官[16]。

目前，國內關于BVDV感染小鼠的致病性和動物模型研究較少，為了探索BVDV感染小鼠后的致病性。本研究利用腹腔注射的方式誘導BVDV感染BALB/c小鼠，并通過病理組織學、血液學和熒光定量PCR的方法對收集到的血液和組織進行檢測。探究攻毒之后BVDV在小鼠體內的感染情況以及白細胞、血小板和淋巴細胞的變化情況，比較BVDV在小鼠血液和組織之間感染的差異，以及BVDV感染小鼠后產(chǎn)生的病理變化和臨床癥狀。為更好地研究BVDV感染動物模型的建立和致病性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

SPF級雌鼠BALB/c(18～22 g)36只購自成都達碩實驗動物有限公司；本研究攻毒組隨機分為3組，分別為Z6組、DJ2組和OregonC24V組，另設1個對照組，共4組，每組各9只BALB/c小鼠。

1.2 毒株、儀器及主要試劑

BVDV1-Z6和BVDV1-DJ2分離株由本實驗室分別從牦牛腹瀉糞便和健康牦牛糞便樣本中分離得到，病毒TCID50·100 μL-1分別為10-8.11和10-5.81，兩株分離株均屬于致細胞病變型；OregonC24V毒株購自中國藥品生物制品檢定所；一次性1 mL無菌注射器；牛腎上皮細胞(MDBK)；DMEM培養(yǎng)基；熒光定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司；BM860血常規(guī)分析儀購自泰安市泰諾科貿有限公司；QuickTaqHS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；DNA Marker Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司；Prime ScriptTMRT試劑盒購自寶生物工程有限公司；Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)購自上海英駿生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

3株不同來源的BVDV毒株經(jīng)過MDBK細胞接種繁毒后保存于-80 ℃冰箱備用。將BALB/c小鼠飼養(yǎng)在無菌條件的動物房，在小鼠適應1 d之后，攻毒組OregonC24V、Z6和DJ2每只小鼠各自腹腔注射6.0×106TCID50病毒液。對照組每只小鼠各自腹腔注射1 mL DMEM。攻毒完成后每天觀察小鼠的活動狀況和精神狀態(tài)并記錄。

1.4 病料采集

攻毒后第5、7和10天每組各處理3只小鼠并采集組織、糞便和血液等樣本，每天定時稱量小鼠體重。本研究通過眼眶采血的方式收集血液，并用枸櫞酸三鈉作為抗凝劑收集血液用于血常規(guī)檢測(白細胞、血小板、淋巴細胞)。在無菌操作臺上解剖小鼠并觀察其臟器的病理變化，采集每只小鼠腸道、心、肝、脾、肺、腎等組織。對收集到的組織一部分用于BVDV抗原的檢測，另一部分則用4%的多聚甲醛固定液固定，用于HE染色并觀察其病理變化。

1.5 RNA提取

將糞便樣品和組織樣品反復研磨，加入1 mL生理鹽水，經(jīng)過反復凍融后，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清。參照上海英俊生物科技有限公司Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說明書提取從小鼠身上采集到的各組織和糞便的RNA，取500 μL上清液加入700 μL的Trizol,室溫靜置10 min；加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min， 取上清液；加入等體積的異丙醇充分顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min， 棄上清液，加入1 mL 75%(經(jīng)DEPC處理過的滅菌水配制)乙醇；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用15 μL經(jīng)過DEPC處理過的無菌水溶解沉淀，置-80 ℃冰箱備用。利用Prime Script TMRT試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 組織熒光定量PCR的檢測

應用本實驗室已建好的熒光定量PCR方法對采集的組織和糞便中BVDV的感染率進行檢測。引物序列：F-CTCAGCGAAGGCCGAAAA；R-CAGGGCTTCAGCCATCCA，目的片段100 bp。反應體系20 μL：SYBR Ⅱ 10 μL，引物F/R均為10 pmol·L-1各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。熒光定量PCR反應程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，61 ℃ 30 s，最后新增一個溶解段，擴增40個循環(huán)。

1.7 血液血常規(guī)的測定及相關組織HE染色

將加有抗凝劑(枸櫞酸三鈉)的血液使用BM860血常規(guī)分析儀進行血常規(guī)檢測，主要包括血小板(PLT)、白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)。另外用4%多聚甲醛固定液固定后的肺、脾、肝、十二指腸、空腸和回腸送到成都市里來生物技術有限公司制備切片，并進行HE染色。對得到的數(shù)據(jù)和切片進行收集、觀察和整理。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 攻毒后小鼠的臨床癥狀以及剖解病理變化

在本研究中，3組攻毒組通過腹腔注射接種BVDV病原后，大部分被感染的小鼠都表現(xiàn)出一定的臨床癥狀。主要表現(xiàn)為聚集成堆、被毛粗糙、采食量減少、精神沉郁、輕微腹瀉等。解剖可見攻毒組小鼠肺和肝有出血點，脾邊緣發(fā)紺并伴有腫大，腸道內容物呈黃色水樣狀，Z6組與DJ2組相比，Z6組病理變化更加明顯。整個試驗過程中，對照組小鼠沒有明顯的臨床癥狀和病理變化。

2.2 熒光定量PCR擴增檢測

采用熒光定量PCR方法對BVDV在小鼠體內的感染情況進行檢測，統(tǒng)計結果如表1。結果發(fā)現(xiàn)：攻毒后第5天，Z6組和DJ2組中空腸、結腸以及OregonC24V組中肺、十二指腸、結腸沒有檢測到BVDV，其他組織均能檢測到BVDV；攻毒第7天，Z6組空腸，DJ2組空腸、結腸以及OregonC24V組肺、空腸、回腸、結腸沒有檢測到BVDV，其他組織均能檢測到BVDV；攻毒第10天，除Z6組空腸、回腸，DJ2組肝、回腸、結腸等組織外，其他組織均能檢測到BVDV；OregonC24V組中在肺、肝、脾、十二指腸和空腸中能檢測到BVDV。在整個試驗過程中，攻毒組小鼠糞便中均能檢測到BVDV，而對照組小鼠組織和糞便均不能檢測到BVDV。從組織檢測率來看，肺、肝和脾的檢出率高于其他組織，Z6組高于DJ2組，猜測小鼠肺和肝可能是BVDV復制的主要器官。

2.3 攻毒后小鼠的體重變化

小鼠攻毒后，每天定時稱量并記錄小鼠體重變化。如圖1所示：可以看出，攻毒后第7天與第5天相比，Z6組小鼠體重顯著降低(P<0.05)；攻毒第7天，DJ2組和OregonC24V組小鼠體重有明顯的降低趨勢，且差異極顯著(P<0.01)，Z6組差異顯著(P<0.05)；攻毒第10天，Z6組和DJ2組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，OregonC24V組差異極顯著(P<0.01)。整個試驗過程中，攻毒組體重增加無明顯變化，而對照組小鼠體重增加明顯。

表1小鼠組織中BVDV的熒光定量PCR檢測結果

Table1ThedetectionofBVDVinmicetissuesbyfluorescencequantitativePCR

樣品Sample第5天第7天第10天Z6DJ2OregonC24VZ6DJ2OregonC24VZ6DJ2OregonC24V肺2/31/30/32/32/30/33/31/31/3肝2/31/32/32/31/31/32/30/32/3脾1/31/32/31/32/31/31/31/31/3十二指腸1/33/30/33/31/31/32/31/31/3空腸0/30/32/30/30/30/30/31/31/3回腸1/31/31/31/31/30/30/30/30/3結腸0/30/30/31/30/30/32/30/30/3糞便3/32/33/33/33/32/33/33/33/3

表格中分數(shù)的分母代表檢測的樣本數(shù)量，分子代表BVDV檢測呈陽性的樣本數(shù)量

The denominator of the score in the table represents the number of tissue samples, the numerator represents the number of samples tested positive for BVDV

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)The * indicate significant difference (P<0.05), the ** indicate extremely significant difference (P<0.01)圖1 攻毒組和對照組小鼠攻毒后體重變化Fig.1 Changes of body weight of mice in the experimental group and the negative control group

2.4 血液血常規(guī)檢測

將加有枸櫞酸三鈉作為抗凝劑的血液使用BM860血常規(guī)分析儀測定小鼠血液中白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)和血小板(PLT)在攻毒后的變化情況。從圖2中可以看出，小鼠經(jīng)腹腔注射BVDV后，OregonC24V組、Z6組和DJ2組的白細胞、淋巴細胞和血小板均降低且低于小鼠正常值。如圖2中A圖所示：攻毒第5天，Z6組白細胞低于對照組且差異顯著(P<0.05)；攻毒第7天，Z6組和OregonC24V組白細胞顯著低于對照組且差異極顯著(P<0.01)，DJ2組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；攻毒第10天，Z6組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，OregonC24V組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

如圖2中B圖所示：攻毒第5天，Z6組和DJ2組淋巴細胞顯著(P<0.05)低于對照組；攻毒第7天，Z6組和OregonC24V組淋巴細胞顯著(P<0.05)低于對照組；攻毒第10天，Z6組淋巴細胞極顯著(P<0.01)低于對照組，OregonC24V組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；在整個試驗過程中，Z6組和OregonC24V組淋巴細胞持續(xù)降低，攻毒第10 天降低到最低。

如圖2中C圖所示：攻毒后DJ2組總體呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，而Z6組在整個試驗過程中持續(xù)降低。攻毒第7天，DJ2組血小板含量低于對照組，且差異顯著(P<0.05)；Z6組和OregonC24V組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；攻毒第7天，DJ2組和對照組血小板含量高于第5和第10 天；攻毒第10天，DJ2組血小板與對照組相比差異顯著(P<0.05)；而對照組基本保持不變且在正常范圍內。血常規(guī)結果表明BVDV感染BALB/c小鼠后，能引起小鼠白細胞、淋巴細胞和血小板降低。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)The * indicate significant difference (P<0.05), the ** indicate extremely significant difference (P<0.01)圖2 攻毒組和對照組小鼠攻毒后體內白細胞(圖A)、淋巴細胞(圖B)、血小板變化圖(圖C)Fig.2 The changing of leukocyte (Fig.A), lymphocytes (Fig.B), platelets (Fig.C) in infected mice of the experimental group and the negative control mice

2.5 組織病理學變化

從組織病理學觀察，如圖3所示。攻毒第5天，HE染色可觀察到DJ2組十二指腸黏膜下層少量炎性細胞浸潤(圖3A)，肺出血(圖3D)等病理變化。Z6組小鼠脾紅髓內巨噬細胞增多；攻毒第7天，DJ2組和OregonC24V組肝細胞內可見空泡或顆粒樣物質，肺泡內大量蛋白樣物質沉積、間質內中性粒細胞浸潤(圖3F)，其他病理變化與攻毒第5天類似。Z6組十二指腸可見固有層內大量淋巴細胞聚集(圖3B)，肝細胞可見空泡樣變形(圖3H)，少量肝細胞呈灶狀壞死和炎性細胞浸潤，肺可見部分肺泡萎縮，肺泡腔塌陷，體積明顯變??；攻毒第10天，OregonC24V組肝細胞質內出現(xiàn)少量空泡狀物質，肝出血(圖3I)，十二指腸腸絨毛上皮細胞及固有層細胞壞死或脫落(圖3C)，脾內淋巴細胞和吞噬細胞增多。而DJ2組中肝細胞可見少量顆粒狀物質，肝細胞質內出現(xiàn)少量空泡狀物質(圖3G)，肝竇內可見深染的圓形單核樣細胞浸潤，脾內淋巴細胞增多，細胞排列致密，空腸黏膜上皮細胞出現(xiàn)壞死、脫落。Z6組肺泡萎縮、血管內大量蛋白樣物質沉積(圖3E)，脾紅髓區(qū)域內巨噬細胞不同程度增多，空腸和回腸可見上皮及固有層細胞不同程度的壞死或脫落，壞死區(qū)域細胞核溶解消失，細胞質均質紅染等病理變化。HE染色結果表明BVDV感染小鼠后可導致組織病理上的變化，且Z6組與DJ2組相比，病理變化更明顯，而對照組無明顯病理變化。

A. 十二指腸黏膜下層少量炎性細胞浸潤(↑)，400×；B. 十二指腸固有層內大量淋巴細胞聚集(↑)，400×；C. 十二指腸腸絨毛上皮細胞(↑)及固有層細胞(↓)壞死或脫落，100×；D. 肺出血(↓)，400×；E. 肺泡萎縮(↑)、血管內大量蛋白樣物質沉積(↓)，100×；F. 肺泡內大量蛋白樣物質沉積(↑)、間質內中性粒細胞浸潤(↓)，400×；G. 肝細胞質內出現(xiàn)少量空泡狀物質(↑)，400×；H. 肝細胞空泡樣變性，400×；I. 肝出血(↑)，100×A. Duodenal submucosa inflammatory cell infiltration (↑), 400×; B. A large number of lymphocyte aggregates in the duodenal lamina propria (↑)， 400×; C. Duodenal villous epithelial cells (↑) and lamina propria cells (↓) necrosis or shedding, 100×; D. Lung hemorrhage (↓), 400×; E. Alveolar atrophy (↑), intravascular deposition of large amounts of protein-like substances (↓), 100×; F. Large amount of protein-like substance deposition in alveoli (↑), intrastromal neutrophil infiltration (↓), 400×; G. A small amount of vacuoles in the cytoplasm of the liver (↑), 400×; H. Liver cell vacuolar degeneration, 400×; I. Liver hemorrhage (↑), 100×圖3 攻毒小鼠部分主要病理變化(HE染色)Fig.3 Main pathological changes in inoculated mice (HE staining)

3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起犢牛腹瀉的重要病原，給世界養(yǎng)牛行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[17]。有研究表明用該病毒對血清學BVDV抗體陰性犢牛以鼻孔噴霧途徑進行接種試驗，犢牛出現(xiàn)明顯的白細胞總數(shù)減少、體溫升高、呼吸困難等癥狀[18]。也有研究通過人工感染BVDV后的妊娠母羊和胚胎以及所生羔羊，除了產(chǎn)生明顯的臨床癥狀外，剖解還可見消化道黏膜彌散性出血、腸系膜淋巴結腫大等病理變化[19]。有學者證實新西蘭兔飲食被BVDV污染的干草，試驗第5天兔被成功感染且大多數(shù)器官檢測呈陽性，淋巴器官出現(xiàn)了典型的組織學變化[20]。相比其他實驗動物，小鼠更為方便，因此本試驗以BALB/c小鼠為試驗動物，通過腹腔注射病毒的方式感染小鼠，小鼠不僅出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，而且還表現(xiàn)出病理組織上的變化。

本研究通過腹腔注射致細胞病變的BVDV1型毒株感染BALB/c小鼠后出現(xiàn)了精神萎靡、扎堆、被毛粗糙、腹瀉等臨床癥狀。解剖可觀察到肝和肺有出血點，脾邊緣發(fā)紺和腫脹。血常規(guī)檢測結果表明OregonC24V組、Z6組和DJ2組小鼠白細胞、淋巴細胞和血小板含量都降低。有研究表明低毒力致細胞病變的BVDV1型毒株能引起小鼠血液中血小板和淋巴細胞的降低[21-22]，本研究血常規(guī)結果與該結果吻合，而對照組在整個試驗過程中，白細胞、淋巴細胞和血小板都明顯高于攻毒組，且在正常范圍內。熒光定量PCR方法可以從攻毒組小鼠肺、脾、肝和十二指腸等組織以及糞便中不同程度檢測到BVDV，且肺和肝中BVDV的檢出率明顯高于其他組織，Z6組BVDV檢出率高于DJ2組，據(jù)該試驗結果推測小鼠肺和肝可能是BVDV病原的主要復制器官。有學者通過腹腔注射非致細胞病變型BVDV1也能在小鼠不同組織中檢測到BVDV病原[23]，該結果與本研究類似。

為分析小鼠感染BVDV病原后對組織造成的病理變化，組織HE染色可見肝的靜脈周圍及肝竇內見少量炎性細胞浸潤，腸黏膜出現(xiàn)不同程度的壞死和脫落，在整個試驗過程中，Z6組和DJ2組與OregonC24V組相比，Z6組病理變化最嚴重，DJ2組較輕。有研究通過口服致細胞病變的BVDV1型毒株感染6～8周齡小鼠后不僅出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，且注射高劑量組的小鼠出現(xiàn)體重減輕、白細胞和淋巴細胞下降[21]，該研究結果與本研究相符。另外有研究顯示通過腹腔注射BVDV的方式感染小鼠沒有出現(xiàn)任何典型的臨床癥狀，但BVDV病原能夠在試驗組的脾中檢測到[24]，這與本研究結果存在一定的差異，這些差異可能與病毒感染部位以及病毒毒力強弱有關，也有可能是由于病毒感染途徑和攻毒劑量的不同所導致。

4 結 論

以BALB/c小鼠為試驗對象，腹腔注射3株 致細胞病變BVDV1型毒株。根據(jù)臨床癥狀的變化、血常規(guī)、HE染色和組織分布等結果，表明成功誘導BALB/c小鼠感染致細胞病變型BVDV。該結果可進一步為BVDV病原感染小鼠動物模型的建立和致病性的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考和指導。