高閃電，王積棟，獨(dú)軍政，鄭福英，田占成，殷 宏,2*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046； 2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

牛流行熱(bovine ephemeral fever，BEF) 是由牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)引起的黃牛、奶牛、肉牛及水牛的一種急性、非接觸性傳染病。該病由媒介昆蟲蚊和庫蠓傳播，發(fā)病動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱、眼鼻分泌物增多、肌肉收縮僵硬、暫時(shí)性的跛足、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀，通常發(fā)病快而病程短，持續(xù)1～3 d，嚴(yán)重時(shí)可表現(xiàn)為黏膜化膿、顫抖、癱瘓及死亡。BEF傳播迅速，流行面廣，廣泛分布于埃及、贊比亞、肯尼亞、澳大利亞、印度、印度尼西亞、巴勒斯坦、日本和中國(guó)等多個(gè)國(guó)家，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。BEFV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、暫時(shí)熱病毒屬(Ephemerovirus)的代表性物種，與同屬的阿德萊德里弗病毒(ARV)、貝里墨病毒(BRMV)、科湯卡恩病毒(KOTV)、奧博第安病毒(OBOV)、金伯利病毒(KIMV)、馬拉科病毒(MALV)、普仲病毒(PUCV)、庫爾平耶病毒(KOOLV)以及雅塔病毒(YATV)具有相似的基因結(jié)構(gòu)[3-7]。

BEFV基因組為單股負(fù)鏈RNA，編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)5種結(jié)構(gòu)蛋白[8]。G蛋白橫跨病毒囊膜，是BEFV關(guān)鍵免疫保護(hù)性抗原，也是病毒中和抗體的作用靶點(diǎn)，該蛋白含4個(gè)抗原位點(diǎn)，其中G1、G2、G3是主要中和位點(diǎn)[9]。在G蛋白和L蛋白編碼基因之間含5個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白GNS和附屬蛋白α1、α2、α3、β、γ，為暫時(shí)熱病毒所特有[10]。GNS蛋白與G蛋白結(jié)構(gòu)相似，來源可能與G基因重復(fù)復(fù)制有關(guān)。α1具有病毒離子孔道蛋白作用，并且定位于高爾基復(fù)合體，可與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白β1以及核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白-7結(jié)合，在核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮作用[11]。

在我國(guó)建國(guó)前后就有BEF流行的記載[12]，但直至1955年才被正式報(bào)道，于1976年分離獲得病毒HVRI1/Bejing-1/JB76H株[13]、amH株以及BH株[14]。目前，該病在我國(guó)臺(tái)灣以及內(nèi)地的26個(gè)省區(qū)均有流行，感染動(dòng)物包括黃牛、奶牛、水牛、牦牛、白牦牛等[15-18]。BEF的流行具有一定的周期性，在我國(guó)中部流行周期為5～7年，小范圍流行周期短至2～3年[19]。1976年以來，研究人員從北京、浙江、河南、山東分離獲得了不同時(shí)期的毒株，包括Beijing-1、JT02L、LS11、LYC11以及BEFV-SD等，均屬于東亞分支[19-20]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)早期分離的JT02L株基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)α3和β基因的ORF均發(fā)生較大的變化，而且在β和γ基因間隔存在外源序列的重組，可能與病毒的毒力密切相關(guān)[21]，但目前沒有關(guān)于我國(guó)BEFV近期分離株的基因組信息，因此我們測(cè)定獲得了HN1/2012株的全基因組序列，并與澳大利亞、中東、國(guó)內(nèi)早期的參考毒株進(jìn)行了系統(tǒng)比較分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛流行熱病毒HN1/2012株牛體傳代病毒抗凝血，保存于本實(shí)驗(yàn)室。該毒株于2012年7月采自河南省洛陽市周邊急性發(fā)熱的高熱期奶牛，本實(shí)驗(yàn)室定期于每年冬天無蚊、蠓活動(dòng)時(shí)接種抗體陰性的成年牛進(jìn)行傳代，采集高熱期(體溫達(dá)40.0 ℃以上)的EDTA抗凝血，于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、一步法RNA RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、PremixTaqTM、DNA純化試劑盒、DL2000 DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒，購自大連TaKaRa公司；pGEM T-easy載體、連接酶為Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞Trans5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中收錄的澳大利亞BEFV BB7721株的全基因組序列(GenBank登錄號(hào)：AF234533)以及我國(guó)早期分離株Beijing-1的部分基因組序列(GenBank登錄號(hào)：JX564640、U72399、AY854642)設(shè)計(jì)覆蓋BEFV基因組的11對(duì)引物(表1)，用于擴(kuò)增11個(gè)DNA片段。每相鄰的2個(gè)DNA片段具有部分重疊，用于后續(xù)基因組序列拼接。

表1引物序列

Table1Thesequencesoftheprimers

引物Primers引物序列(5'→3')Primer Sequences位置/ntPositions產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProduct lengthsBEFV1FACGAGAAAAAACAAAAAAAC1820BEFV1RGATACAAAAATCCAATCAAG820BEFV2FACAAGGATGCCGCAGGAC7702 079BEFV2RTTCCCTCTTCTTTTGCTC2 848BEFV3FATTCATCCTAGAGATC2 7331 458BEFV3RACCATTCCCCCTCTTGTTG4 190BEFV4FCTCTGTTTGTCCTTACCAG4 1082 071BEFV4RAATGACAGTATCTTCATCAG6 178BEFV5FGTGAGTACATAACAGGTC6 1082 025BEFV5RGCTAGATCTAATCTCCT8 132BEFV6FGGGTAGTGCCTACATG7 930631BEFV6RCTCTACTAAAGGATCT8 560BEFV7FGAAGAGGAGTCCATG8 4831 304BEFV7RGATGAGTTTGGAGATC9 786BEFV8FCCTAAAGAGTTAGAAG9 0172 012BEFV8RTGTCCTCTGATTGCTGG11 028BEFV9FCAGACAATCAGCATGTG10 6042 181BEFV9RTACAGTTCCTTGAAGTGC12 784BEFV10FAAATTTGACGCATCGCAG12 7181 701BEFV10RTCCTGATCTGAGTATGGT14 418BEFV11FAGTCATCTAGTAACAACAAAG14 345556BEFV11RACGAAGAAAAACAAATAAAATAC14 900

1.4 RNA提取

根據(jù)RNAiso Plus試劑操作說明，從BEFV HN1/2012傳代病毒抗凝血提取總RNA。將保存于-80 ℃的抗凝血充分解凍后取300 μL至無RNase離心管中，加入800 μL RNAiso Plus，加入200 μL氯仿，混合均勻后室溫放置5 min。然后12 000 g 4 ℃離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，加入700 μL的異丙醇混勻、室溫放置10 min 后，12 000 g 4 ℃離心10 min。棄去上清并加入800 μL 75%乙醇，混勻后12 000 g 4 ℃離心 5 min，小心棄去上清，室溫干燥沉淀5 min，加入50 μL 無RNase水溶解RNA。

1.5 RT-PCR和基因克隆

根據(jù)一步法RNA RT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系為利用2 ×Buffer 25 μL、 RNase Free dH2O 18 μL、上游引物和對(duì)應(yīng)的下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、Enzyme Mix 2 μL、RNA 3 μL，混勻后按反應(yīng)程序50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)后72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，用1%瓊脂糖電泳并切膠回收目的條帶，與pGEM T-easy載體連接后轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，利用PremixTaq進(jìn)行菌落PCR鑒定，將初步鑒定為陽性重組菌培養(yǎng)、提取質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 基因組序列、基因結(jié)構(gòu)及演化分析

利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站中的VecScreen在線軟件分析測(cè)序獲得的各片段并去除載體序列，之后利用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，獲得病毒全基因組序列。參考GenBank收錄的澳大利亞BB7721株的基因組信息(AF234533)，根據(jù)BEFV基因的轉(zhuǎn)錄起始(TI)和轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化(TTP)序列，確定各基因的位置及對(duì)應(yīng)的開放閱讀框(ORF)，推導(dǎo)各基因的氨基酸序列，注釋后提交GenBank，獲序列號(hào)。利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件，采用Clustal W的方法進(jìn)行比對(duì)，分析各基因和核苷酸及其編碼氨基酸與參考毒株BB7721(AF234533)、Ad12/TUR(KY012742)、JT02L(KY315724)的序列相似性。以HN1/2012株糖蛋白G基因的胞外結(jié)構(gòu)域編碼序列(1 572 nt)進(jìn)行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在線比對(duì)分析，下載同源序列，利用重組檢測(cè)軟件包RDP4中的RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、SiScan、3Seq、LARD等方法進(jìn)行檢測(cè)，分析HN1/2012株基因可能發(fā)生的重組。利用Mega6軟件包進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析HN1/2012株的分類地位。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的11對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，得到了與預(yù)期大小相符的11個(gè)目的片段，與預(yù)期大小一致，片段長(zhǎng)度分別為 820、2 079、1 458、2 071、2 025、631、1 304、2 012、2 181、1 701、556 bp(圖1)。

M. DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～11. 引物對(duì)1～11(參見表1)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker; 1-11. RT-PCR product amplified with primer pairs 1-11 (see Table 1)圖1 RT-PCR擴(kuò)增BEFV全基因組Fig.1 The RT-PCR amplification of complete genome of BEFV

2.2 克隆鑒定和測(cè)序

菌落PCR鑒定顯示，成功將11個(gè)基因片段克隆到pGEM T-easy載體中。將陽性重組菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序、拼接，獲得了HN1/2012株的全基因組序列，全長(zhǎng)為14 899 nt。該序列已提交GenBank，登錄號(hào)為KM276084。

2.3 基因組結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)BEFV基因的TI和TTP序列對(duì)HN1/2012株基因組進(jìn)行分析注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HN1/2012株與參考毒株BB7721、Ad12/TU具有相似的基因組結(jié)構(gòu)：各基因均含有保守的TI序列UUGUCC，在轉(zhuǎn)錄形成的mRNA含有5′-cap-AACAGG-結(jié)構(gòu)；除β基因的TTP序列為GUAC[U]6，其余基因的TTP序列均為GUAC[U]7，在轉(zhuǎn)錄的mRNA具有CATG(A)7結(jié)構(gòu)。此外，α1基因和α2基因由于具有共同的TI和TTP序列而位于同一轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，在α2的ORF 75—230位編碼另一讀碼框不同的附屬蛋白α3。HN1/2012株基因組包含前導(dǎo)序列(50 nt，1—50 位)、N基因(1 328 nt，51—1 378位)、P基因(858 nt，1 405—2 262位)、M基因(691 nt，2 306—2 996位)、G基因(1 896 nt，3 044—4 939位)、GNS基因(1 785 nt，4 993—6 777位)、α1α2基因(638 nt，6 815—7 452位)、β基因(459 nt，7 492—7 950位)、γ基因(400 nt，7 981—8 380位)、L基因(6 470 nt，8 360—14 829位)、尾隨序列(70 nt，14 830—14 899位)。相鄰的基因由基因間隔區(qū)(IGR)連接，包括：N-P(26 nt)、P-M(43 nt)、M-G(47 nt)、G-GNS(53 nt)、GNS-α1α2(37 nt)、α1α2-β(39 nt)、β-γ(30 nt)、γ-L(-21 nt，即基因之間含21 nt重疊區(qū))。HN1/2012株G基因在轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)下游與ORF之間的非編碼區(qū)存在一個(gè)A堿基缺失，總體符合經(jīng)典的BEFV基因組特征。

2.4 基因組變異分析

序列比較分析發(fā)現(xiàn)，HN1/2012株全基因組與本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的我國(guó)2002年分離株JT02L的核苷酸相似性最高(99.3%)，其次為土耳其2012年分離株Ad12/TUR(92.3%)和澳大利亞1968年分離株BB7721(90.5%)。在核苷酸水平，不同BEFV毒株之間最為保守的基因組功能區(qū)段為前導(dǎo)序列和尾隨序列，其次為N基因(平均相似性為95.8%)、γ基因、L基因和α1基因(平均相似性為94.2%～94.8%)，M基因、β基因、G基因、GNS基因的核苷酸序列變異較大(平均相似性為93.0%～94.0%)。在氨基酸水平，N蛋白氨基酸序列最為保守(平均相似性為99%)，其次為M蛋白、L蛋白、G蛋白(平均相似性為97.2%～98.1%)。γ蛋白、β蛋白、GNS蛋白、α1蛋白的氨基酸變異較大(平均相似性91.4%～94.9%)。P、α2、α3基因核苷酸和氨基酸平均相似性分別為89.9%～91.9%和71.5%～90.8%，均存在較大變異。總體上，HN1/2012株基因組各基因與JT02L株相比變異較小，與我國(guó)早期分離株Beijing-1的抗原G基因的相似性也高于國(guó)外分離株BB7721和Ad12/TUR，但其附屬蛋白尤其α3與參考毒株Beijing-1的核苷酸、氨基酸均存在較大差異(表2)，說明附屬蛋白在我國(guó)BEFV毒株演化中也可能發(fā)揮作用。HN1/2012株與河南地區(qū)2011年BEFV分離株LS11、LYC11以及2002年浙江分離株JT02L的G蛋白表位一致。與我國(guó)疫苗株JB76H相比，這些毒株G3表位突變發(fā)生于53位 (K→N)和263位(G→E)；G4表位(G蛋白455—482位)的突變發(fā)生于461位(K→E)和475位(I→M)， 與山東2011年分離株變異基本相同，但后者在476位增加了E→D突變；G1表位(487—503位)和G2表位(168—189位)在我國(guó)大陸分離株保守(圖2)。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

BLAST結(jié)果顯示，HN1/2012株G蛋白胞外結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)與我國(guó)(內(nèi)地及臺(tái)灣)、日本分離株以及部分2012年中東分離株(TR/CU15、TR/CU16、TR/CP3)和埃及分離株(EGY12)的核苷酸相似性為95.0%～99.0%，與中東其他分離株的核苷酸相似性為92.0%～93.0%，與澳大利亞分離株的核苷酸相似性為90.0%～91.0%。與GenBank中收錄的BEFV全基因組和G基因的參考序列進(jìn)行重組檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)HN1/2012株基因重組現(xiàn)象。利用Mega6軟件進(jìn)行演化分析，BEFV毒株可分為東亞譜系、中東譜系以及澳大利亞譜系，與之前報(bào)道一致[19, 22-25]。HN1/2012株處于東亞分支，這一大的分支還包括我國(guó)內(nèi)地所有的其他BEFV分離株、我國(guó)臺(tái)灣分離株以及日本的分離株(圖3)。土耳其2012年的分離株TR/CU15、TR/CU16、TR/CP3和埃及分離株EGY12也處于東亞分支。HN1/2012株與我國(guó)河南2011年分離株LS11的親緣關(guān)系最近，核苷酸和氨基酸的相似性均為99.6%，其次為河南分離株LYC11以及山東2011年分離株，核苷酸和氨基酸相似性分別為98.7%～99.4%和98.8%～99.6%，這些毒株構(gòu)成了一個(gè)新的亞支，在起源上密切相關(guān)。此外，HN1/2012株與中國(guó)1976年分離株JB76H以及2002年分離株JT02L分支距離較遠(yuǎn)，但與2013—2014年中國(guó)臺(tái)灣分離株和日本2015年分離株、土耳其2012年分離株CU15、CU16、CP3距離相對(duì)較近，可能在演化上密切相關(guān)。

表2HN1/2012株與參考毒株各基因編碼區(qū)核苷酸和編碼氨基酸的相似性

Table 2 Percentage of nucleotide and amino acid similarity between individual gene coding region of HN1/2012 and reference viral strains%

—.無氨基酸序列；斜體數(shù)字表示氨基酸序列相似性

—. No amino acid sequences; The similarity of amino acid sequences are shown in italic script

圖2 HN1/2012株與參考毒株G蛋白表位比較Fig.2 Comparation of the epitopes on the G protein of HN1/2012 strain and reference viral strains

3 討 論

自1867年在東非首次報(bào)道BEF，該病至今已有150余年的歷史。影響B(tài)EF傳播的因素較多，氣象和環(huán)境因素(如季風(fēng)及其風(fēng)速和方向、溫度和濕度、季雨)及地理造成媒介昆蟲的分布變化、動(dòng)物的運(yùn)輸都可影響該病的傳播，甚至造成不同大陸間遠(yuǎn)距離傳播[2]。繼20世紀(jì)30年代巴勒斯坦、印度、印度尼西亞、日本報(bào)道BEF之后，我國(guó)于1955年正式報(bào)道在廣東省發(fā)現(xiàn)該病。至1991年該病在我國(guó)多次流行，遍布我國(guó)南部和中部的多個(gè)省區(qū)，而且在北方的遼寧、吉林也有報(bào)道[12]。我國(guó)河南地區(qū)關(guān)于該病的記載比較系統(tǒng)，自1983年至今有8次較大的BEF流行，其中最近的報(bào)道為2011年，發(fā)病率為30%，死亡率達(dá)5%[19]，同期在我國(guó)山東地區(qū)也報(bào)道了該病的流行，且分離株與河南2011年分離株在演化上密切相關(guān)[26]。

圖3 BEFV毒株G基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on G gene of BEFV strains

RNA病毒的演化因素包括同源重組、基因突變、病毒基因組節(jié)段的重排等。據(jù)推測(cè)，Shandong2011株在G基因編碼區(qū)230—472位的變異可能與澳大利亞和中東毒株的同源重組有關(guān)[26]。本研究測(cè)定了HN1/2012株的基因組序列，分析表明其基因組結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的參考毒株相似。在已知的BEFV基因組序列中，HN1/2012株與我國(guó)2002年分離株JT02L的相似性最高，尤其二者編碼的P、α1、γ蛋白的氨基酸相似性為100%，但二者G基因存在一定的差異，與早期分離株JB76H的G基因差異相對(duì)較大，這些差異表明我國(guó)不同地區(qū)BEFV抗原基因存在多態(tài)性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HN1/2012株與當(dāng)?shù)赝诜蛛x株LS11、LYC11高度同源，而且這些毒株G表位完全一致。目前我國(guó)在BEF流行的地區(qū)，多采用以JB76H株制備的疫苗對(duì)牛進(jìn)行接種，抗原基因的變異可能更有利于BEFV毒株的生存。重組分析在HN1/2012株基因組和LS11株、LYC11株的G基因均未發(fā)現(xiàn)基因同源重組信號(hào)，這些毒株的演化可能與免疫壓力導(dǎo)致的基因突變密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

測(cè)定了我國(guó)近期BEFV分離株HN1/2012基因組序列，解析了其基因組特征，在基因組水平上明確了其與我國(guó)2002年分離株JT02L相似性最高，與中東譜系和澳大利亞毒株存在較大差異。G基因的演化分析表明HN1/2012株與同期我國(guó)河南株親緣關(guān)系最近，在毒株起源上密切相關(guān)。HN1/2012株基因組信息的獲得，彌補(bǔ)了我國(guó)最近流行周期毒株基因組信息的缺失，為基于全基因組的BEFV分子演化研究奠定了基礎(chǔ)。