朱彥策，孔江南，陳慧心，鐘 凱，張 超

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)、環(huán)二腺苷酸(c-di-AMP)和環(huán)腺苷酸-鳥苷酸(cGAMP)作為第二信使分子，日益成為研究的熱點(diǎn)。c-di-GMP作為在細(xì)菌中合成的第二信使分子，參與細(xì)菌生理活動(dòng)的許多方面，例如：生物被膜的形成、分化、運(yùn)動(dòng)性、毒力及胞外多糖的形成[1-5]。盡管在真核細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)天然存在的c-di-GMP，但是已有研究報(bào)道在小鼠和人細(xì)胞中轉(zhuǎn)入c-di-GMP后，可以通過TBK-IRF3信號(hào)通路刺激I型干擾素的生成[6-7]，預(yù)示它可以作為潛在的免疫佐劑。cGAMP是一種新發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物第二信使，可以結(jié)合并且激活干擾素基因刺激因子(STING)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生I型干擾素，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答反應(yīng)[8-9]。并且已有研究報(bào)道利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化得到的環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶能夠在體外酶促合成c-di-GMP[10-13]。

霍亂弧菌中的DncV(VC0179)是一種環(huán)二核苷酸環(huán)化酶，可以利用ATP和GTP作為底物催化合成c-di-GMP、cGAMP和c-di-AMP[14]。為了研究VC0179的催化功能以及通過體外酶促反應(yīng)合成產(chǎn)生c-di-GMP和cGAMP，需要一種簡(jiǎn)單、快速的方法檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP。迄今為止已經(jīng)開發(fā)了一些體外檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的方法，包括高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)、高效液相色譜(HPLC)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和薄層色譜分析(TLC)[15-18]。這些方法雖然已被證明有效，但是它們也存在一些缺點(diǎn)。例如，HPLC雖然分析小分子比較靈敏，可以檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP，但是對(duì)于體外酶促反應(yīng)體系來說，需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募兓僮魅コ傅鞍椎却蠓肿?，耗費(fèi)時(shí)間和人力。TLC雖然能夠快速檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP，但是待檢測(cè)物通常需要放射性標(biāo)記，對(duì)操作者健康產(chǎn)生潛在的不利影響。

最近，RNA適配體逐漸成為能夠在體外和體內(nèi)檢測(cè)小分子的通用工具。Paige等[19]發(fā)現(xiàn)了一種基于RNA的適配體：spinach，其一旦與3,5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone，DFHBI)結(jié)合，能夠產(chǎn)生類似綠色熒光蛋白的激發(fā)熒光。Kellenberger等[20]將天然的GEMM-I核糖開關(guān)與spinach適配體結(jié)合，構(gòu)建得到的適配體用于細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP和cGAMP檢測(cè)[21-22]。為了檢測(cè)體外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP，本研究將VC2 GEMM-I核糖開關(guān)和它的突變體VC2/g20a連接到spinach2和tRNA支架上，開發(fā)出了一種基于RNA的核酸適配體，spinach2與spinach相比具有更高的熱穩(wěn)定性和折疊效率[23]

本研究以含有T7啟動(dòng)子、VC2 GEMM-1核糖開關(guān)序列或其突變序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的雙鏈DNA為模板，利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄體系制備VC2、VC2/g20a RNA適配體。通過檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度分析RNA適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的結(jié)合能力以及VC2和VC2/g20a適配體的檢測(cè)下限，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

VC0179蛋白編碼序列由寶生物工程(大連)有限公司合成；含有T7啟動(dòng)子、VC2或VC2/g20a適配體、spinach2和tRNA序列的單鏈DNA(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I購(gòu)自TaKaRa公司；T7 RNA聚合酶、NTP混合物、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核酸酶I、RNA酶、無機(jī)焦磷酸酶和DEPC水購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；ATP、GTP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Aladdin公司；IPTG購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Ni-NTA Agarose購(gòu)自QIAGEN公司；DFHBI購(gòu)自Lucerna technologies(美國(guó))；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、膠回收試劑盒、RNA純化試劑盒、PCR純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞及含His標(biāo)簽的IPTG誘導(dǎo)型載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

表1本研究中使用的單鏈DNA序列

Table1ThesinglestrandDNAsequencesusedinthisstudy

名稱Name序列(5'→3')SequenceVC2適配體VC2 aptamer CGATCCCGCGAAATtaatacgactcactataGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGAT-GTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCACACGCACAGGGCAAACCATTCGAAAGAGT-GGGACGCAAAGCCTCCGGCCTAAACCAGAAGACATGGTAGGTAGCGGGGTTACCGATGTTGTT-GAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCC-TGTTCGGGCGCCAVC2/g20a適配體VC2/g20a aptamer CGATCCCGCGAAATtaatacgactcactataGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGAT-GTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCACACGCACAGAGCAAACCATTCGAAAGAGT-GGGACGCAAAGCCTCCGGCCTAAACCAGAAGACATGGTAGGTAGCGGGGTTACCGATGTTGTT-GAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCC-TGTTCGGGCGCCA

小寫的序列表示T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子，下劃線的序列表示tRNA支架，斜體序列表示spinach 2適配體，粗體序列分別表示VC2適配體和VC2 / g20a適配體

The lowercase sequences indicate the promoter for T7 RNA polymerase, underlined sequences indicate tRNA scaffold, italic sequences indicate spinach2 aptamer, and bold sequences indicate VC2 aptamer and VC2/g20a aptamer, respectively

1.2 RNA適配體的制備

以合成的單個(gè)DNA作為模板并采用以下引物：Sp-u:5′-CGATCCCGCGAAATTAATACG-3′,Sp-d:5′-TGGCGCCCGAACAGGGAC-3′，通過PCR得到用于體外轉(zhuǎn)錄的線性雙鏈DNA(dsDNA)，PCR產(chǎn)物dsDNA經(jīng)PCR純化試劑盒純化。以dsDNA為模板體外轉(zhuǎn)錄得到RNA適配體：1 μg dsDNA，60 U T7聚合酶，NTPs(各6 mmol·L-1)，80 U RNase抑制劑，0.3 U無機(jī)焦磷酸酶，加ddH2O至100 μL，混合均勻后37 ℃孵育4 h。孵育后加入2 U DNase I并孵育15 min以消化DNA模板，然后用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收。用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 VC0179的表達(dá)和純化

將VC0179編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后用BamH I和XhoI雙酶切，回收后連接至IPTG誘導(dǎo)型載體的BamH I和XhoI位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選陽(yáng)性克隆菌小提質(zhì)粒，用BamH I和XhoI雙酶切驗(yàn)證后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，37 ℃ 培養(yǎng)。待其OD600 nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1 mmol·L-1，室溫誘導(dǎo)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min收集菌體，加入裂解緩沖液(50 mmol·L-1NaH2PO4·H2O，300 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑)重懸，低溫超聲破碎，然后4 ℃ 13 000 r·min-1離心30 min除去細(xì)胞碎片。取上清液用QIAGEN公司的Ni-NTA填料按照操作說明書進(jìn)行蛋白純化，根據(jù)說明書用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 VC0179體外酶促合成c-di-GMP和cGAMP

用先前報(bào)道的方法由VC0179合成c-di-GMP和cGAMP[14]：1 μmol·L-1VC0179與2 mmol·L-1的GTP合成c-di-GMP，1 μmol·L-1VC0179與各2 mmol·L-1的GTP和ATP合成cGAMP；反應(yīng)體系均為100 μL，緩沖液中包含5 mmol·L-1MgCl2和10 mmol·L-1HEPES(pH 7.5)。37 ℃孵育3 h后，將反應(yīng)溶液在99 ℃煮沸5 min，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液進(jìn)行c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)。

1.5 RNA適配體檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP

在100 μL反應(yīng)體積中，將100 nmol·L-1純化的RNA適配體與指定濃度的c-di-GMP或cGAMP在25 ℃下孵育結(jié)合，結(jié)合緩沖液中包含1 mmol·L-1DFHBI、40 mmol·L-1HEPES(pH 7.5)、125 mmol·L-1KCl和30 mmol·L-1MgCl2；將5 μL轉(zhuǎn)錄的RNA混合物與90 μL VC0179反應(yīng)溶液在相同的結(jié)合緩沖液中25 ℃孵育3 h。然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔黑色板中，在熒光和化學(xué)發(fā)光分析儀(激發(fā)：450 nm；發(fā)射：530 nm)中測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有測(cè)量經(jīng)過3次重復(fù)。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。利用Graphpad Prism5軟件的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性判斷，P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RNA適配體與c-di-GMP和cGAMP結(jié)合條件的優(yōu)化

已有研究結(jié)果表明，一價(jià)和二價(jià)金屬離子可以通過穩(wěn)定RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)RNA折疊[24-27]。因此，本試驗(yàn)過改變K+和Mg2+濃度來優(yōu)化RNA適配體與c-di-GMP和cGAMP的結(jié)合。該RNA適配體通過利用T7 RNA聚合酶體轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄得到的RNA加熱變性、緩慢退火得到。隨著KCl從0 mmol·L-1增加到150 mmol·L-1，熒光強(qiáng)度逐漸增加。當(dāng)MgCl2的濃度從0 mmol·L-1增加到50 mmol·L-1時(shí)，可以得到類似結(jié)果：在30 mmol·L-1MgCl2下，VC2和VC2/g20a適配體分別與c-di-GMP和cGAMP結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比分別增加大約5.6倍和4.3倍(圖1a)。在125 mmol·L-1KCl溶液中，與未添加KCl的對(duì)照相比VC2和VC2/g20a適配體與c-di-GMP和cGAMP結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別增加約7倍和5.3倍(圖1b)。

然后檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。RNA適配體與c-di-GMP和cGAMP配體孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的熒光越強(qiáng)(圖1c)。當(dāng)在25 ℃孵育180 min時(shí)，VC2和VC2/g20a適配體的熒光強(qiáng)度分別增加到8.3倍和5.1倍。綜合上述結(jié)果，優(yōu)化的試驗(yàn)條件定為RNA適配體與c-di-GMP和cGAMP配體在125 mmol·L-1KCl和30 mmol·L-1MgCl2溶液中孵育180 min。

a、b、c分別為MgCl2、KCl濃度和結(jié)合時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。所有的測(cè)量經(jīng)過3次重復(fù)，數(shù)據(jù)誤差用標(biāo)準(zhǔn)差表示，下同a,b, c. Effect of MgCl2, KCl concentrations and binding time on the fluorescence intensity produced by VC2 and VC2/g20a aptamers. All measurements were conducted with 3 duplicates and error bars represent the S.D, the same as below圖1 RNA適配體與c-di-GMP和cGAMP結(jié)合的條件優(yōu)化Fig.1 Condition optimizing for c-di-GMP and cGAMP binding to RNA aptamers

2.2 VC2和VC2/g20a適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)極限

為確定VC2和VC2/g20a適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP檢測(cè)的靈敏度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加的c-di-GMP和cGAMP從10-9mol·L-1增加到10-3mol·L-1時(shí)，兩個(gè)適配體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度逐漸增加。通過將熒光強(qiáng)度和相應(yīng)的c-di-GMP、cGAMP濃度作圖，得到兩條較好的擬合曲線(圖2a)。根據(jù)結(jié)合曲線，可以得到c-di-GMP對(duì)VC2適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為(89±1.7) nmol·L-1，cGAMP對(duì)VC2/g20a適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度為(309±4.5) nmol·L-1。

為了確定兩種適配體的檢測(cè)限，適配體的濃度保持在100 nmol·L-1，c-di-GMP和cGAMP的濃度從0 nmol·L-1增加到100 nmol·L-1。通過對(duì)熒光強(qiáng)度與相應(yīng)的配體濃度作圖，二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(VC2適配體R2=0.992 3，線性范圍：5～100 nmol·L-1；VC2/g20a適配體R2=0.983 4，線性范圍：20 ～100 nmol·L-1)(圖2b)。另外從圖上可以看到，VC2和VC2/g20a適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)限分別為5 nmol·L-1和20 nmol·L-1。

a. VC2和VC2/g20a適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)靈敏度；b. VC2和VC2/g20a適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)限。未添加c-di-GMP和cGAMP配體的樣品熒光強(qiáng)度作為背景扣除a. The sensitivity of VC2 and VC2/g20a aptamers detecting c-di-GMP and cGAMP; b. The detection limit of VC2 and VC2/g20a aptamers towards c-di-GMP and cGAMP. Background without ligand was removed from every point圖2 確定VC2和VC2/g20適配體分別對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)限Fig.2 The datection sensitivity and limit of VC2 and VC2/g20 aptamers towards c-di-GMP and cGAMP, respectively

2.3 RNA適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的選擇性

為了確定適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的選擇性，使用VC2和VC2/g20a適配體分別檢測(cè)c-di-GMP、cGAMP、c-di-AMP、ATP和GTP；其中以VC2適配體的C92U突變體(VC2/c92u)作為陰性對(duì)照。在優(yōu)化的結(jié)合條件下，與不加配體的對(duì)照相比，VC2適配體選擇性結(jié)合c-di-GMP并產(chǎn)生5.9倍的熒光強(qiáng)度。VC2/g20a適配體與cGAMP特異性結(jié)合，相對(duì)于陰性對(duì)照樣品產(chǎn)生接近4.3倍的熒光強(qiáng)度(圖3)。VC2/g20a適配體也能夠與c-di-GMP結(jié)合并產(chǎn)生明顯的激發(fā)熒光，這與Kellenberger等[20]報(bào)道的數(shù)據(jù)相似。

2.4 檢測(cè)VC0179體外合成的c-di-GMP和cGAMP

為了簡(jiǎn)單、快速的測(cè)定體外酶合成的c-di-GMP和cGAMP，本研究使用轉(zhuǎn)錄后未經(jīng)純化的RNA適配體混合物來檢測(cè)VC0179合成的c-di-GMP和cGAMP。與未添加GTP的陰性對(duì)照相比，VC2適配體可以與VC0179合成的c-di-GMP結(jié)合并產(chǎn)生大約3.2倍的熒光強(qiáng)度(圖4a,P<0.01)。與未添加ATP和GTP的陰性對(duì)照相比，VC2/g20a適配體結(jié)合VC0179合成的cGAMP后，可以產(chǎn)生接近2.5倍的熒光強(qiáng)度(圖4b,P<0.01)。上述數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄的RNA適配體混合物能夠檢測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的c-di-GMP和cGAMP。

3 討 論

第二信使分子c-di-GMP和cGAMP能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生I型干擾素，具有潛在作為疫苗佐劑功能，因此，c-di-GMP和cGAMP對(duì)家畜重大疫病的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。目前獲得c-di-GMP和cGAMP的一個(gè)方法是通過化學(xué)合成，此方法雖然可行但也存在一些不足，比如：合成步驟復(fù)雜、成本高[10]。另一個(gè)主要方法是通過體外酶促反應(yīng)獲得，例如Korovashkina等[11]利用重組的環(huán)化酶在體外合成c-di-GMP，最近Launer-Felty和Strobel[28]報(bào)道利用環(huán)化酶體外合成c-di-GMP和cGAMP。與此同時(shí)，對(duì)于酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)也是一個(gè)需要研究的重要問題。以往檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的方法包括HPLC-MS/MS、HPLC、FRET、TLC等，這些方法雖然有效但也存在缺點(diǎn)。例如使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP時(shí)儀器操作復(fù)雜，準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)，并且檢測(cè)成本高。而高效液相色譜檢測(cè)酶促合成的c-di-GMP和cGAMP時(shí)需要去除產(chǎn)物中的酶蛋白，耗費(fèi)人力和物力等[15-18]。

VC2和VC2/g20a適配體及其陰性對(duì)照(VC2/c92u)與配體(ATP、ATP+GTP、c-di-AMP、c-di-GMP和cGAMP)在優(yōu)化的條件下結(jié)合，并測(cè)定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。將不含配體的樣品熒光值作為背景扣除The VC2 and VC2/g20a aptamers and their negative control(VC2/c92u) bound to the ligands (ATP, ATP + GTP, c-di-AMP, c-di-GMP and cGAMP) under optimal binding conditions and the corresponding fluorescence intensities were detected. Fluorescence was normalized by sample without ligands圖3 RNA適配體對(duì)不同配體的選擇性Fig.3 The selectivity of RNA aptamers toward different ligands

a.轉(zhuǎn)錄的VC2適配體混合物檢測(cè)VC0179合成的c-di-GMP；b.轉(zhuǎn)錄的VC2/g20a適配體混合物檢測(cè)VC0179合成的cGAMP。***. P<0.001a. Transcribed VC2 aptamer mixture detected c-di-GMP by VC0179 synthesized; b. Transcribed VC2/g20a aptamer mixture detected cGAMP by VC0179 synthesized. ***. P<0.001圖4 RNA適配體混合物對(duì)VC0179合成的c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)Fig.4 Transcribed RNA mixture was used to detect c-di-GMP and cGAMP by VC0179 synthesized

因此為了研究體外酶促反應(yīng)合成產(chǎn)生的c-di-GMP和cGAMP，需要一種方法能夠簡(jiǎn)單、快速的對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。本研究通過將VC2核糖開關(guān)和其突變體VC2/g20a與spinach2和tRNA支架融合構(gòu)建得到RNA適配體，通過結(jié)合DFHBI染料產(chǎn)生綠色激發(fā)熒光來檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP，進(jìn)而開發(fā)一種基于RNA適配體的簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的方法。

本研究利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄得到的RNA經(jīng)過加熱變性和緩慢退火后，得到RNA適配體[29]。RNA適配體由3個(gè)模塊構(gòu)建(圖5)：(1)與c-di-GMP和cGAMP結(jié)合區(qū)域; (2)spinach2區(qū)域；(3)tRNA支架，VC2 GEMM-1核糖開關(guān)或其突變體VC2/g20a用于結(jié)合c-di-GMP或cGAMP；Spinach 2用來結(jié)合DFHBI；tRNA支架增加適配體的熱穩(wěn)定性[30]。在沒有c-di-GMP或cGAMP時(shí)，RNA適配體不能夠產(chǎn)生激發(fā)熒光；在有c-di-GMP或cGAMP存在時(shí)，RNA適配體與c-di-GMP或cGAMP結(jié)合后，spinach2形成封閉結(jié)構(gòu)，能夠與DFHBI結(jié)合，形成的復(fù)合物在450 nm波長(zhǎng)激發(fā)下產(chǎn)生類似綠色熒光蛋白的激發(fā)熒光。

圖5 用于檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的RNA適配體的示意圖Fig.5 Schematic illustration of designed RNA aptamers for detecting c-di-GMP and cGAMP

已有文獻(xiàn)報(bào)道一價(jià)和二價(jià)金屬離子能夠促進(jìn)RNA折疊并且穩(wěn)定形成三級(jí)結(jié)構(gòu)[24-27]，所以在本研究中，通過改變結(jié)合溶液中的K+和Mg2+濃度和孵育時(shí)間，對(duì)RNA適配體檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在含有30 mmol·L-1MgCl2和125 mmol·L-1KCl的結(jié)合溶液中孵育180 min的優(yōu)化條件下，VC2適配體對(duì)c-di-GMP的檢測(cè)限為5 nmol·L-1；VC2/g20a適配體對(duì)cGAMP的檢測(cè)限為20 nmol·L-1。同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP對(duì)VC2適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為(89±1.7)nmol·L-1，cGAMP對(duì)VC2/g20a適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度為(309±4.5) nmol·L-1。這表明，本研究構(gòu)建的兩種RNA適配體對(duì)c-di-GMP和cGAMP的檢測(cè)是靈敏的，并且能夠在較大的范圍內(nèi)檢測(cè)到c-di-GMP和cGAMP。

此外，本研究通過使用VC2和VC2/g20a適配體分別檢測(cè)c-di-GMP、cGAMP、c-di-AMP、ATP和GTP，試驗(yàn)結(jié)果證明，VC2適配體能夠特異性的檢測(cè)c-di-GMP，VC2/g20a適配體能夠特異性的檢測(cè)cGAMP，這與先前報(bào)道的研究結(jié)果相似[20]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，VC2和VC2/g20a適配體對(duì)ATP和GTP沒有明顯的結(jié)合能力，這說明酶促反應(yīng)產(chǎn)物中的底物ATP和GTP對(duì)RNA適配體檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的結(jié)果沒有影響，因此可以使用VC2和VC2/g20a適配體直接檢測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物中的c-di-GMP和cGAMP，并且該檢測(cè)方法是靈敏的。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA適配體混合物也能夠顯著檢測(cè)體外VC0179酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。這就進(jìn)一步簡(jiǎn)化了使用RNA適配體檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的步驟，使得使用VC2和VC2/g20a適配體分別檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP時(shí)更加簡(jiǎn)單、快速，同時(shí)也為在其他條件下檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP提供了可能。需要說明的是，如果要定量檢測(cè)體外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP，需要用c-di-GMP和cGAMP標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且給出相應(yīng)的線性范圍。

4 結(jié) 論

本研究通過將VC2核糖開關(guān)和其突變體VC2/g20a與spinach2和tRNA支架融合構(gòu)建得到RNA適配體，開發(fā)了一種基于RNA適配體簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP的方法，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA混合物也能夠較靈敏地檢測(cè)VC0179酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。這種檢測(cè)方法也為在其他條件下檢測(cè)c-di-GMP和cGAMP提供了可能。