吳正常，馮海悅，黃焱杰，吳麗思，吳圣龍,2，包文斌,2*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 2. 揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

仔豬腹瀉是許多規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)最為常見的一類疾病，對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]，其中F18大腸桿菌(E.coliF18)是目前規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)仔豬細(xì)菌性腹瀉最普遍、致病性較強(qiáng)的病原之一[2]。F18大腸桿菌致病機(jī)理已經(jīng)相對(duì)清楚，主要通過菌毛特異性的吸附小腸上皮細(xì)胞表面相應(yīng)的受體，從而定居，大量繁殖，產(chǎn)生的腸毒素進(jìn)入小腸細(xì)胞內(nèi)引起一系列免疫反應(yīng)和病理效應(yīng)，進(jìn)而刺激腸上皮細(xì)胞分泌大量液體進(jìn)入腸腔，引起仔豬腹瀉。因此，仔豬抵抗F18大腸桿菌感染，關(guān)鍵在于小腸上皮細(xì)胞F18大腸桿菌受體表達(dá)與否以及機(jī)體腸道固有免疫能力的差異。目前，研究發(fā)現(xiàn)，α(1,2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(alpha (l,2) fucosyltransferase)基因1(FUT1)是控制F18菌毛與小腸黏膜受體結(jié)合的重要候選基因，其中編碼區(qū)M307位點(diǎn)G/A突變(丙氨酸→蘇氨酸)作為豬抵抗F18大腸桿菌的一個(gè)遺傳標(biāo)記[3-4]，該標(biāo)記在國(guó)外豬品種(如杜洛克豬)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)抗病育種(申請(qǐng)專利號(hào)：443766)。然而，F(xiàn)UT1基因標(biāo)記在20多個(gè)中國(guó)國(guó)內(nèi)地方豬品種中呈現(xiàn)極端偏態(tài)分布[5-9]，由此表明，適用于引進(jìn)豬種的FUT1基因標(biāo)記并不適用于中國(guó)地方豬品種的抗病育種。本課題組前期以中國(guó)地方品種梅山豬斷奶仔豬為研究對(duì)象，利用F18菌株感染及一系列驗(yàn)證試驗(yàn)獲得了確證的梅山豬F18大腸桿菌抗性與敏感型斷奶仔豬個(gè)體[10]，通過十二指腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選出F18大腸桿菌抗性相關(guān)的重要調(diào)控通路(TLRs信號(hào)通路)及CD14等關(guān)鍵基因，沒有發(fā)現(xiàn)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因如FUT1及其所在的通路發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。由此進(jìn)一步推測(cè)，中外豬品種抵抗F18大腸桿菌感染的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制存在一定的差異。本課題組前期建立了含有國(guó)內(nèi)地方和外來血統(tǒng)的培育品種—蘇太豬(杜洛克×梅山豬)F18大腸桿菌抗性型和敏感型家系群體，運(yùn)用細(xì)菌與小腸上皮細(xì)胞體外黏附試驗(yàn)嚴(yán)格鑒定并篩選出了蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型的全同胞個(gè)體[12-13]，并且利用該樣本在細(xì)胞水平和個(gè)體水平上進(jìn)行了F18大腸桿菌抗性相關(guān)候選基因或蛋白質(zhì)的功能驗(yàn)證[14-20]。

為了系統(tǒng)揭示蘇太豬F18大腸桿菌抗性調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制，本研究對(duì)蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體十二指腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過生物信息學(xué)方法重點(diǎn)篩選重要調(diào)控通路和候選基因，利用qPCR驗(yàn)證重要候選基因分別在梅山豬和蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體十二指腸組織中的差異表達(dá)情況，同時(shí)，在細(xì)胞水平上利用F18大腸桿菌菌體(F18ab、F18ac)分別刺激豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2，利用qPCR和Western blot檢測(cè)重要候選基因和蛋白的表達(dá)變化，繼續(xù)探討蘇太豬和梅山豬在抵抗F18大腸桿菌感染過程中分子機(jī)制的差異，為進(jìn)一步闡明國(guó)內(nèi)外豬品種對(duì)F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎(chǔ)及其差異提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

蘇太豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型斷奶仔豬來自于課題組前期建立的蘇太豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型資源家系群體，前期已經(jīng)通過V型分泌系統(tǒng)展呈功能性黏附素和受體結(jié)合試驗(yàn)技術(shù)嚴(yán)格篩選出E.coliF18抗性型與敏感型全同胞配對(duì)個(gè)體各3頭[12-13]，用于本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析以及組織表達(dá)分析；此外，課題組前期采用F18ab和F18ac菌株口服攻毒試驗(yàn)，并利用仔豬腸道E.coliF18細(xì)菌檢測(cè)、細(xì)菌計(jì)數(shù)以及小腸上皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)獲得了確證的梅山斷奶仔豬E.coliF18抗性型與敏感型個(gè)體[10]，各選取3頭用于本試驗(yàn)的組織表達(dá)分析；蘇太和梅山E.coliF18抗性型與敏感型斷奶仔豬屠宰后，取十二指腸組織置于1.5 mL無酶管中，現(xiàn)場(chǎng)液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｐ∧c上皮細(xì)胞系IPEC-J2由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2、大腸桿菌F18ab、F18ac菌株均由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)所贈(zèng)；胎牛血清FBS、培養(yǎng)液DMEM/F12、胰酶Trypsin-EDTA Solution、細(xì)胞培養(yǎng)孔板均購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(中國(guó)，南京)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱源科技發(fā)展有限公司(中國(guó)，南京);一抗TLR5 (1∶800)、FUT2 (1∶600)、IL-1β (1∶600)購(gòu)自Abcam(Cambridge，UK)；二抗(IgG-HRP，1∶3 000)購(gòu)自Jackson(PA，USA);切膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司(中國(guó)，北京)。

1.3 RNA提取、cDNA文庫(kù)建立以及上機(jī)測(cè)序

使用Trizol法對(duì)樣品進(jìn)行總RNA的抽提。進(jìn)行RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)，包括首先利用Nanodrop檢測(cè)RNA的濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm)，然后通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)RNA是否有降解或污染，最后利用Qubit和Agilent2100分別對(duì)RNA濃度和完整性進(jìn)行精確檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，通過Oligo dT富集、cDNA合成、末端修復(fù)加接頭和PCR擴(kuò)增來進(jìn)行cDNA文庫(kù)建立，最后利用Hiseq4000上機(jī)測(cè)序，數(shù)據(jù)量為6G clean data/樣本。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 差異表達(dá)基因分析 根據(jù)Fold change(差異倍數(shù))和P-value(顯著水平)兩個(gè)指標(biāo)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，閾值設(shè)定一般為|log2(Fold change)|>1且P-value<0.005。不同分組間差異表達(dá)基因的整體分布情況可以用火山圖來表示，所用分析軟件為DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)。

1.4.2 差異表達(dá)基因的功能富集與注釋 利用GOSeq[21]軟件挖掘差異表達(dá)mRNA的主要生物學(xué)功能，包括分子功能(molecular function)、細(xì)胞組成(cellular component)、生物學(xué)過程(biological process)；利用KOBAS[22]軟件分析差異表達(dá)mRNA 的代謝通路注釋(KEGG Pathway)。

1.5 F18大腸桿菌刺激豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2

將大腸桿菌F18ab、F18ac菌株分別接種于LB培養(yǎng)液，200 r·min-1搖菌12 h，3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體，沉淀并離心，反復(fù)操作3次。菌體最后用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至1.0×109CFU·mL-1，按每孔1 mL的量加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，每組有3個(gè)平行樣，4 h后收集細(xì)胞，菌體刺激的IPEC-J2細(xì)胞作為試驗(yàn)組，未作處理的IPEC-J2細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的豬FUT2、IL-1β和TLR5基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物(表1)，以GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，所設(shè)計(jì)引物均跨外顯子，以避免PCR產(chǎn)物中有DNA污染，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，以RNA為模板進(jìn)行cDNA合成：反應(yīng)體系中含2 μL 5 × qRT SuperMix II，500 ng總RNA，無酶水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。Real-time PCR反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，PCR上下游定量引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，0.5 μL ROX Reference Dye II(50×)，2 μL cDNA，ddH2O 9 μL。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；利用擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析擴(kuò)增效果及引物的特異性，具體程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

表1熒光定量PCR所用引物信息

Table1Primerinformationsforreal-timePCR

基因GeneGenBank登錄號(hào)GenBank accession number引物(5'→3')Primer產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLengthTLR5AB208697.2F: GGTTCTCGCCCACCACATTA158R: GGGTCCCAAAGAGTCGGAAGFUT2U70881.2F: AATCCCTGACCTCACTCCGTG123R: CGGAACTACAACTGCTGGCCIL-1βNM_001005149F: TGATTGTGGCAAAGGAGGA63R: TTGGGTCATCATCACAGACGGAPDHNM_001206359.1F: ACATCATCCCTGCTTCTACCGG188R: CTCGGACGCCTGCTTCACβ-actinXM_003124280.3F: TGGCGCCCAGCACGATGAAG149R: GATGGAGGGGCCGGACTCGT

F. 上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R.Reverse primer

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)

以F18菌體刺激前后的豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2為樣本，使用全蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞和組織總蛋白，并通過BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量，使蛋白質(zhì)水平標(biāo)準(zhǔn)化。SDS-PAGE(10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)：取10 μL蛋白質(zhì)上樣，160 V跑膠70 min。Western blot(蛋白印跡)：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF(聚丙烯二氟乙烯)膜上，與相關(guān)抗體進(jìn)行免疫印跡，TLR5 (1∶800)、FUT2 (1∶600)、IL-1β (1∶600)抗體作為一抗，兔原抗體IgG(Abcam, UK, 1∶5 000)作為二抗，β-actin (1∶4 000)作為參照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)內(nèi)參基因GAPDH和β-actin的Ct值取幾何平均數(shù)，并采用2-ΔΔCt法[23]處理相對(duì)定量的結(jié)果，用內(nèi)參基因?qū)Ρ磉_(dá)水平進(jìn)行均一化。利用SPSS 16.0軟件的一般線性模型(general linear model, GLM)對(duì)基因和蛋白在菌體刺激細(xì)胞前后、抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸組織中的表達(dá)差異情況進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸轉(zhuǎn)錄組分析

3頭蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型(SR1、SR2、SR3)個(gè)體與3頭敏感型個(gè)體(SS1、SS2、SS3)十二指腸組織樣本和測(cè)序數(shù)據(jù)均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)后，RNA總量、完整性以及純度均符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)(RIN≥6.5；OD260nm/OD280 nm≥1.8；28S/18S≥1.0)，本研究運(yùn)用RNA-seq技術(shù)獲得蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體十二指腸的轉(zhuǎn)錄本，3頭抗性型(SR1、SR2、SR3)與3頭敏感型(SS1、SS2、SS3)個(gè)體分別獲得1 324 600、1 405 100、1 321 800、1 464 900、1 371 900、1 266 400條raw reads，比對(duì)到豬參考基因組(Sscrofa10.2)上，81.2%～82.7%的reads匹配到參考基因組上，其中68.5%～71.8%屬于特異性匹配；為了進(jìn)一步探究蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體十二指腸的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，利用經(jīng)隨機(jī)方差模型修正后的T-檢驗(yàn)(RVM-T test)計(jì)算測(cè)序所檢測(cè)到的基因表達(dá)的顯著性水平(P-value)，篩選出兩組間差異表達(dá)mRNA共238個(gè)，其中抗性組上調(diào)差異表達(dá)基因(differential expression genes, DEGs)112個(gè)，下調(diào)DEGs 126個(gè)(部分DEGs見表2)。

表2蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸部分差異表達(dá)基因

Table2PartialdifferentialexpressiongenesinduodenumofSutaiE.coliF18-resistantandE.coliF18-sensitiveweanedpiglets

轉(zhuǎn)錄本Transcript基因名稱Gene nameSR_FPKMSS_FPKMlog2(fold change)P值P-valueNM_214055.1IL-1β1.335 800.567 331.235 440.029 10NM_001206441.1TAP23.912 611.841 341.087 380.002 80NM_001123202.1TLR57.831 924.738 400.724 970.015 25NM_214069.1FUT22.534 667.684 35-1.600 130.000 15NM_001123127.1HSP7051.963 3024.470 101.086 470.009 55XM_005666775.1CXCL115.540 312.728 211.022 010.019 50NM_001038004.1MMP94.410 832.189 531.010 430.006 20NM_001160080.1DGAT238.04 8619.714 100.948 610.017 90NM_001244717.1SLC13A277.624 3046.487 900.739 650.012 55NM_001206402.1TRIM3112.423 8029.62 12-1.253 520.000 20XM_003482441.2SCLT12.562 954.236 45-0.725 050.049 70

差異倍數(shù)表示F18大腸桿菌抗性組(SR)/F18大腸桿菌敏感組(SS)

Fold change meansE.coliF18-resistant group (SR) /E.coliF18-sensitive group (SS)

2.2 蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達(dá)基因的功能注釋

差異表達(dá)基因的功能注釋結(jié)果表明，大部分基因主要顯著參與14種GO分類，其中涉及到免疫系統(tǒng)過程(immune system process)、免疫應(yīng)答(immune response)、海藻糖酶活性(trehalase activity)等，具體見表3；篩選的差異表達(dá)基因主要顯著參與20個(gè)pathway通路，其中涉及到免疫相關(guān)通路如Toll樣受體信號(hào)通路(toll-like receptor signaling pathway)(包括TLR5、IL-1β基因)和糖脂類通路(glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series)(包括FUT2基因)，見表4。

2.3 F18大腸桿菌刺激蘇太斷奶仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后重要候選基因表達(dá)變化

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和功能注釋分析，本研究篩選出大腸桿菌F18受體形成相關(guān)基因FUT2[29]，以及免疫調(diào)控相關(guān)基因IL-1β和TLR5[28]。為了進(jìn)一步探究這3個(gè)重要候選基因(FUT2、IL-1β和TLR5)表達(dá)水平與F18大腸桿菌感染的關(guān)系，分別通過F18ab、F18ac菌體刺激小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，并利用qPCR和Western blot檢測(cè)FUT2、IL-1β和TLR5表達(dá)變化。結(jié)果顯示(圖1)，F(xiàn)18ab和F18ac菌體刺激小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后，3個(gè)基因均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，進(jìn)一步的Western blot驗(yàn)證結(jié)果和qPCR相一致(圖2)。

2.4 重要候選基因在斷奶仔豬F18抗性型與敏感型個(gè)體的差異表達(dá)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組篩選出來的重要差異表達(dá)基因(FUT2、IL-1β和TLR5)，本研究在課題組前期獲得的梅山豬和蘇太豬斷奶仔豬F18抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸組織中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，TLR5基因在蘇太豬抗性組十二指腸組織中表達(dá)水平極顯著高于敏感組(P<0.01)，IL-1β顯著高于敏感組(P<0.05)，而FUT2在敏感組中極顯著高于抗性組(P<0.01)(圖3)；TLR5、IL-1β基因在梅山豬抗性組十二指腸組織中表達(dá)水平均極顯著高于敏感組(P<0.01)，而FUT2在梅山豬抗性組和敏感組中表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

表3蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

Table3Geneontology(GO)enrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinduodenumofSutaiweanedpiglets

GO登錄號(hào)GO accession No.名稱DescriptionP值P value基因名稱Gene nameGO:0008009趨化因子活性Chemokine activity0.015 022CXCL9, AMCF-II, CXCL13GO:0042379趨化因子受體結(jié)合Chemokine receptor binding0.015 022CXCL11, CCL20, CXCL9, AMCF-II, CXCL10, CXCL13GO:0004555α,α-海藻糖酶活性alpha,alpha-trehalase activity0.015 022TREH, GBP7, LOC100620987GO:0015927海藻糖酶活性Trehalase activity0.015 022TREH, LOC100620987, GBP7GO:0002376免疫系統(tǒng)過程Immune system process0.015 022CD2, LOC100621671, AMCF-II, IL1β, CCL20, CXCL13, CXCL9, CXCL10, CXCL11GO:0005991海藻糖代謝途徑Trehalase metabolic process0.021 547TREH, LOC100620987, GBP7GO:0005525GTP結(jié)合GTP binding0.021 547PCK1, GIMAP2, GBP5, EEF1A1, GBP6, LOC100516289, GBPGO:0032561甲脒基核糖核苷酸結(jié)合Guanyl ribonucleotide binding0.021 547TAP2, FUT2, LOC102161784GO:0019001甲脒基核苷酸結(jié)合Guanyl nucleotide binding0.021 547GBP5, TAP2, FUT2, PCK1, LOC102167556, RABGO:0005984二糖代謝Disaccharide metabolic process0.021 547TREH, LOC100620987, GBP7GO:0006955免疫應(yīng)答Immune response0.021 547CCL20, AMCF-II, IL1β, CXCL13, CXCL11, CXCL10GO:0001664G-蛋白耦合受體結(jié)合G-protein coupled receptor binding0.021 547CXCL13, AMCF-II, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL20GO:0009311寡糖代謝途徑Oligosaccharide metabolic process0.027 832INMT, TREH, GBP7GO:0005125細(xì)胞因子活性Cytokine activity0.033 923CXCL11, CCL20, CXCL9, AMCF-II, CXCL10, CXCL13

表4蘇太斷奶仔豬十二指腸差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

Table4KEGGpathwayanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinduodenumofSutaiweanedpiglets

Pathway名稱Pathway descriptionPathway登錄號(hào)Pathway accession No.P值P value基因名稱Gene name亞油酸代謝Linoleic acid metabolismssc005910.000 000 725ALOX12, 12-LOX, ALOX15, PLA2G2D, CYP3A29維生素代謝Retinol metabolismssc008300.000 961 878BCMO1, CYP2C49, CYP1A1, CYP3A46, CYP3A88花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolismssc005900.001 851 731GPX2, ALOX12, 15-LOX, ALOX15, PLA2G2D

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

Control表示對(duì)照組；F18ab表示F18ab菌體刺激IPEC-J2；F18ac表示F18ac菌體刺激IPEC-J2。*. P<0.05Control represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation. *. P<0.05圖1 F18大腸桿菌刺激小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后重要差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證Fig.1 qPCR validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation

NC表示對(duì)照組；F18ab表示F18ab菌體刺激IPEC-J2；F18ac表示F18ac菌體刺激IPEC-J2NC represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation圖2 F18大腸桿菌刺激小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后重要差異表達(dá)基因的Western blot驗(yàn)證Fig.2 Western blot validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation

SR表示蘇太豬F18抗性組；SS表示蘇太豬F18敏感組。*. P<0.05，**. P<0.01，下同SR represents the Sutai E. coli F18-resistant group; SS represents the Sutai E. coli F18-sensitive group; *. P<0.05; **. P<0.01, the same as below圖3 重要候選基因在蘇太豬F18抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸組織中的差異表達(dá)分析Fig.3 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Sutai E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals

MR表示梅山豬F18抗性組；MS表示梅山豬F18敏感組MR represents the Meishan E. coli F18-resistant group; MS represents the Meishan E. coli F18-sensitive group圖4 重要候選基因在梅山豬F18抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸組織中的差異表達(dá)分析Fig.4 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Meishan E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals

3 討 論

仔豬抵抗F18大腸桿菌感染，關(guān)鍵在于小腸上皮細(xì)胞F18大腸桿菌受體表達(dá)與否以及機(jī)體腸道免疫調(diào)控能力的差異[16]。Coddens等[24]通過對(duì)不同日齡的74頭長(zhǎng)白豬進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加，E.coliF18受體的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，尤其是在0～3周齡逐漸升高，而在3～23周齡維持平衡狀態(tài)。未斷奶的仔豬對(duì)大腸桿菌不敏感，不僅是因?yàn)榇竽c桿菌受體尚未形成，也由于母源抗體能夠保護(hù)仔豬免受致病菌感染[25]。因此，本研究選擇35日齡斷奶仔豬，這一時(shí)期無論表型還是自身的免疫機(jī)制，都表現(xiàn)出最易感染F18大腸桿菌。

基于課題組前期對(duì)梅山豬F18大腸桿菌抗性相關(guān)基因及其調(diào)控通路的研究[11]，本研究嚴(yán)格選擇蘇太豬F18大腸桿菌抗性型和敏感型斷奶個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出2個(gè)重要調(diào)控通路：Toll樣受體信號(hào)通路(KO. 04620)和鞘糖脂合成通路(KO. 00601)，以及重要差異表達(dá)基因(TLR5、IL-1β、FUT2)。TLR5、IL-1β均屬于Toll樣受體(TLR)家族基因，Toll樣受體(TLR)家族能夠識(shí)別保守的微生物結(jié)構(gòu)(如細(xì)菌脂多糖)并激活信號(hào)通路，從而導(dǎo)致由微生物感染引起的免疫應(yīng)答[26]。TLR能夠感應(yīng)腸道中的微生物群體，并啟動(dòng)促炎信號(hào)通路來抵抗微生物病原體的入侵，研究表明，TLRs在機(jī)體激活固有免疫和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的防御機(jī)制，特別是在先天性固有免疫中起著重要作用[27]。TLRs家族中，TLR5是機(jī)體識(shí)別革蘭氏陰性菌鞭毛蛋白的受體，鞭毛蛋白是革蘭氏菌鞭毛的主要成分，它可以直接被體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞識(shí)別，TLR5與鞭毛蛋白結(jié)合后，將進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，而刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)機(jī)體針對(duì)病原菌的先天性免疫及炎癥反應(yīng)[28]。大腸桿菌F18受體最小抗原決定簇是ABH血型抗原中的1型H抗原[29-31]，由α-(1, 2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(FUT1、FUT2)催化的1型H-抗原被稱為組織血型抗原，它主要分布在分泌液，起源于組織的外胚層和中胚層中，而不是在紅細(xì)胞膜表面[31-33]。基于以上研究報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，一方面通過F18大腸桿菌菌體刺激IPEC-J2細(xì)胞后，F(xiàn)UT2、TLR5、IL-1β的表達(dá)均顯著上調(diào)，另一方面對(duì)其在抗性型與敏感型個(gè)體腸道組織中表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FUT2在敏感組中極顯著高于抗性組(P<0.01)，而TLR5、IL-1β基因在抗性組中表達(dá)水平均顯著高于敏感組(P<0.05)，綜合兩者結(jié)果，在細(xì)胞水平和個(gè)體水平上驗(yàn)證表明，TLR5、IL-1β、FUT2基因表達(dá)水平與F18大腸桿菌感染有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體信號(hào)通路及其CD14基因在梅山斷奶仔豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中起免疫調(diào)控作用[11]，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合功能驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體信號(hào)通路及其TLR5和IL-1β基因、鞘糖脂合成通路及其FUT2基因表達(dá)水平與蘇太豬F18大腸桿菌抗性有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT1是控制F18菌毛與小腸黏膜受體結(jié)合的重要候選基因，成功運(yùn)用于外來品種(如杜洛克豬)F18大腸桿菌的抗性育種[3-4]，并且FUT1屬于鞘糖脂合成通路基因。綜合以上研究表明，Toll樣受體信號(hào)通路(包括CD14、TLR5、IL-1β等基因)和鞘糖脂合成相關(guān)通路(包括FUT1、FUT2等基因)可能在斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體信號(hào)通路和鞘糖脂合成通路在培育品種—蘇太豬(梅山豬×杜洛克)F18大腸桿菌抗性中均發(fā)揮重要調(diào)控作用，而梅山斷奶仔豬中僅僅發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號(hào)通路與F18大腸桿菌抗性有關(guān)[11]；在引進(jìn)品種(如杜洛克豬)成功實(shí)現(xiàn)抗病育種的FUT1標(biāo)記在幾十個(gè)國(guó)內(nèi)地方豬品種(包括梅山豬)中呈現(xiàn)極端偏態(tài)分布[5-9]；本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT2在蘇太豬抗性型與敏感型個(gè)體十二指腸組織中的表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)，而F18大腸桿菌抗性型與敏感型梅山豬中FUT2表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。結(jié)合課題組對(duì)中國(guó)地方豬品種(梅山豬)和培育品種(蘇太豬)F18大腸桿菌感染的分子調(diào)控機(jī)制分析以及相關(guān)報(bào)道綜合表明，引進(jìn)與地方豬種F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎(chǔ)確實(shí)存在差異，Toll樣受體信號(hào)通路及其CD14、TLR5基因在中國(guó)地方豬品種—梅山豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用，而鞘糖脂合成通路及FUT2基因在外來品種及蘇太豬(具有外來品種血統(tǒng))調(diào)控F18大腸桿菌受體形成過程中發(fā)揮重要作用，但是該結(jié)論主要基于國(guó)內(nèi)外前期關(guān)于外來品種F18大腸桿菌抗性的相關(guān)研究報(bào)道，下一步還需要在外來品種(如杜洛克豬)中利用前期梅山豬F18抗性相關(guān)通路和功能基因的驗(yàn)證策略[11]來進(jìn)一步的求證。

4 結(jié) 論

本研究利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了中外雜交培育品種—蘇太豬F18大腸桿菌抗性的分子調(diào)控機(jī)制，并從mRNA、蛋白質(zhì)、個(gè)體和細(xì)胞水平上驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TLR5、IL-1β基因在梅山豬和蘇太豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用，而FUT2基因僅在蘇太豬(具有外來品種血統(tǒng))調(diào)控F18大腸桿菌受體形成過程中發(fā)揮重要作用，由此推測(cè)，引進(jìn)與地方豬品種F18大腸桿菌抗性的遺傳基礎(chǔ)存在差異，對(duì)于解釋引進(jìn)與地方豬品種存在抗病力差異這一現(xiàn)象具有重要的科學(xué)意義。