紀(jì)潤(rùn)璧，顧紅兵

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目前已廣泛應(yīng)用于胃癌檢測(cè)的血液腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、癌抗原（CA）系列等，診斷的靈敏度相對(duì)較低。尋找有效的胃癌診斷分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。膠原是微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，近年來(lái)研究提示Ⅺ型膠原的特異性裂解片段 α1鏈（collagen typeⅪ alpha 1 chain，COL11A1）可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。已有文獻(xiàn)報(bào)道COL11A1參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲［2］。但COL11A1在胃癌患者血清中表達(dá)如何，是否可以作為新的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，目前國(guó)內(nèi)外缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)了胃癌患者血清中COL11A1基因的表達(dá)水平，分析了其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，評(píng)估了其作為胃癌診斷新指標(biāo)的潛能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年1月至2018年3月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科就診的胃癌患者50例，其中男36例，女14例，年齡46～84歲，平均年齡（68±8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：組織病理學(xué)確診為胃癌；術(shù)前未行放化療和其他抗腫瘤治療；無(wú)嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾患。排除標(biāo)準(zhǔn)：近6個(gè)月內(nèi)使用激素類(lèi)藥物或免疫抑制劑者；合并嚴(yán)重心肝腎功能不全者；有手術(shù)禁忌證者。收集患者臨床信息，包括年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和TNM分期等。

選取同期年齡和性別匹配的健康體檢者25例，男17例，女8例，年齡36～78歲，平均年齡（62±10）歲。經(jīng)電子胃鏡確診的淺表性胃炎患者25例，男15例，女10例，年齡41～72歲，平均年齡（58±7）歲。樣本采集經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

1.2 血清標(biāo)本采集與處理

胃癌患者于術(shù)前1 d、健康體檢者于體檢時(shí)、淺表性胃炎患者于門(mén)診就診時(shí)采集2mL外周靜脈血，常規(guī)離心（3 000 r／min）10 min，血清分裝后 -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)COL11A1 mRNA的表達(dá)

TRIzol LS試劑（美國(guó)Therom公司）提取血清中總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)Vazyme公司）說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照 UltraSYBR qRT-PCR Mixture試劑盒（中國(guó)Vazyme公司）說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系。qPCR總反應(yīng)體系為20μL，包括上、下游引物（10μmol／L）各 0.4μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2μL，無(wú)RNA酶去離子水6.8μL和ROX 0.4μL。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，78℃ 31 s，共 40個(gè)循環(huán)。選取 β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因，采用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行分析。COL11A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平以 2-△△Ct法統(tǒng)計(jì)：△△Ct＝［（樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因）-（對(duì)照組 Ct目的基因-對(duì)照組 Ct管家基因）］。COL11A1上游引物序列為 5′-AGTGGCATCGGGTAGCAATCA-3′，下游引物序列為 5′-TGTCCCCCTCAAAAACTTCTTCAT-3′。β-肌動(dòng)蛋白上游引物序列為 5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為 5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者血清中COL11A1 mRNA的表達(dá)

COL11A1 mRNA在胃癌患者血清中的表達(dá)（5.196±1.417）較健康體檢者（1.398±0.182）明顯升高（t＝2.659，P＜0.05），而淺表性胃炎患者血清 COL11A1 mRNA表達(dá)（1.011±0.129）與健康體檢者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.791，P＞0.05）。

2.2 COL11A1 mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在非胃癌人群中（包括健康體檢者和淺表性胃炎患者），血清COL11A1 mRNA表達(dá)與性別、年齡無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）。見(jiàn)表1。在胃癌組中，COL11A1 mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤最大徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 非胃癌人群血清COL11A1表達(dá)與性別和年齡的關(guān)系

2.3 胃癌血清COL11A1的ROC曲線和診斷效能評(píng)價(jià)

以健康體檢者和淺表性胃炎患者為對(duì)照組（50例），胃癌患者為疾病組（50例），繪制ROC曲線分析COL11A1的診斷價(jià)值。胃癌患者血清COL11A1的ROC曲線下面積為0.811，95%可信區(qū)間（CI）為0.680～0.942，當(dāng)臨界值為 1.583時(shí)，敏感性為75%，特異性為76.5%。

表2 胃癌組血清COL11A1表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程離不開(kāi)細(xì)胞外基質(zhì)的支持［3］。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)最重要的組成部分，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。其中纖維性膠原含量最為豐富，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型。Shen等［5］發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)性非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)COL11A1，介導(dǎo)Smad信號(hào)通路體外促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲。Jia等［6］認(rèn)為COL11A1能夠活化間質(zhì)干細(xì)胞成為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后不良。有報(bào)道證實(shí)胃癌組織高表達(dá)COL11A1，可能調(diào)控CDK6等下游靶點(diǎn)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，阻滯胃癌細(xì)胞凋亡［7］。這些數(shù)據(jù)提示，COL11A1可能是重要的腫瘤診療靶點(diǎn)。

腫瘤診斷標(biāo)志物中酶類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)的檢測(cè)高度依賴(lài)于抗體的穩(wěn)定性和特異性，而核酸檢測(cè)方法成熟，且成本相對(duì)低廉［8］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增，檢測(cè)到標(biāo)本中的微量核酸，極大提高了靈敏度，廣泛應(yīng)用于液體活檢研究，包括循環(huán)非編碼RNA［9-11］、循環(huán)腫瘤細(xì)胞［12］、外泌體［13-14］等，具有重要的臨床價(jià)值。本研究中，我們證實(shí)常規(guī)總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法能夠檢測(cè)出血清中COL11A1的基因表達(dá)水平。同時(shí)，胃癌患者血清中COL11A1 mRNA的表達(dá)明顯高于淺表性胃炎患者和健康體檢者。

本研究分析了血清COL11A1表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)COL11A1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和TNM分期密切有關(guān)。當(dāng)腫瘤組織侵及漿膜層或漿膜下組織，甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移累及周?chē)K器時(shí)，血清COL11A1表達(dá)升高。提示COL11A1是參與腫瘤發(fā)展的重要分子。ROC曲線分析顯示COL11A1的曲線下面積達(dá)0.811，表明COL11A1是良好的胃癌診斷指標(biāo)。Giussani等［15］報(bào)道血漿 COL11A1是乳腺癌的生物標(biāo)志物，也佐證了我們的結(jié)果。有研究報(bào)道［16］，CEA、CA199、CA724等傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在胃癌中的靈敏度分別為 54.34%、44.69%、48.73%，特異度分別為 75.45%、78.27%、84.94%。我們的結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為1.583時(shí)，COL11A1的敏感性顯著高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。因此，COL11A1有望成為一個(gè)有效的胃癌診療靶點(diǎn)。但是，COL11A1作為腫瘤標(biāo)志物的參考范圍是多少，能否與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)提高診斷效率，其與胃癌預(yù)后關(guān)系如何，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，胃癌患者血清COL11A1基因高表達(dá)，且與腫瘤浸潤(rùn)深度和TNM分期密切相關(guān)，有望成為新的臨床診斷指標(biāo)。