朱靜和，徐昌輝，錢雷，劉青員，蔣鳳，于建秀，劉娟利

（濱海縣人民醫(yī)院1.內(nèi)分泌科，2.檢驗科，江蘇 鹽城224500）

2型糖尿?。═2DM）是常見的慢性代謝性疾?。?］，血管并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要原因。研究表明糖尿病相關(guān)的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）性疾病和急性血栓形成等疾病的發(fā)生風(fēng)險增加，與高血糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、功能障礙和死亡密切相關(guān)［2-3］。白細(xì)胞介素35（IL-35）是一種具有抗炎性能的細(xì)胞因子，在人類和小鼠中可由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞產(chǎn)生［4］。研究表明穩(wěn)定型心絞痛患者血清IL-35濃度顯著降低［5］，但I(xiàn)L-35在T2DM合并頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）病變中的作用尚不清楚。本次研究探討IL-35在高糖條件下對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的作用，從而闡明IL-35在T2DM發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取70例2016年9月至2017年12月在濱?？h人民醫(yī)院診斷為T2DM的患者，其中單純T2DM 36例，T2DM合并CAS 34例。兩組年齡、性別、BMI均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。糖尿病的診斷與分類參照《中國2型糖尿病防治指南》［6］。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴自身免疫性疾病或內(nèi)分泌疾病的糖尿病患者、應(yīng)激性高血糖或1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病、惡性腫瘤、感染性疾病、近期使用抗生素者。同時選擇年齡、BMI、性別相匹配的健康人群35例作為對照組。本研究征得參加者知情同意，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2016—09），臨床資料見表1。

表1 研究對象臨床資料

1.2 儀器和試劑

凋亡檢測試劑盒、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）試劑盒及流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；IL-35及可溶性VCAM-1（sVCAM-1）檢測試劑盒（美國Biorad公司）；貝克曼奧林帕斯AU5800全自動生化分析儀及配套試劑；液相芯片儀（美國 Luminex公司）；實時定量PCR儀7500、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒（Applied Biosystems公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；Ficoll-HyPaque分離液購自上海恒信試劑有限公司；D-葡萄糖粉和重組人IL-35（Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 頸總動脈粥樣硬化檢測 患者取仰臥位，通過彩色多普勒超聲診斷儀測量頸總動脈、頸動脈分叉、頸外動脈和頸內(nèi)動脈任何節(jié)段中的內(nèi)膜中層厚度（intima media thickness，IMT），在兩側(cè)各測 2個點，取平均值。頸動脈斑塊形成或IMT＞0.9 mm定義為CAS病變。

1.3.2 外周血采集 采集所有研究對象空腹外周血8 mL，其中2 mL用于檢測總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、空腹血糖和HbA1c等。2 mL立即分離血清存于-80℃冰箱用于批量分析IL-35濃度。4 mL用于分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）。

1.3.3 外周血IL-35及sVCAM-1濃度檢測 通過Luminex200液相芯片儀檢測所有研究對象血清IL-35及sVCAM-1濃度，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，測2次，取均值。

1.3.4 實時定量 PCR檢測 PBMCs中 P35 mRNA和EBI3 mRNA表達(dá)水平 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法制備PBMCs，使用Trizol試劑從PBMCs分離總RNA，通過cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒擴增IL-12 P35和EBI3。引物設(shè)計：P35正義鏈5′-TCCTCCCTTGAAGAACCGGA-3′，反 義 鏈 5′-TGACAACGGTTTGGAGGGAC-3′；EBI3正義鏈 5′-TCCTTCATTGCCACGTACAG-3′，反義鏈 5′-GCTCTGTTATGAAAGGCACG-3′；β-肌動蛋白正義鏈 5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′反 義 鏈 5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s 40個循環(huán)。mRNA相對表達(dá)水平通過比較Ct方法計算，即相對量為 2-ΔΔCt。

1.3.5 高糖培養(yǎng)HUVECs及分組 無菌條件下取年輕健康孕婦分娩后的臍帶，經(jīng)1 g／L膠原酶和2.5 g／L胰酶消化后，收集消化液于離心管，無菌PBS沖洗臍帶2遍，沖洗液一并收集至離心管中，1 000 r／min離心10 min后棄上清液。離心管內(nèi)加入含20%胎牛血清、100μg／mL鏈霉素、100 U／mL青霉素和2 mmol／L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HUVECs培養(yǎng)3代后以2.5×105密度接種于6孔板中，并按需要分成4組：低糖處理組（5 mmol／L葡萄糖）、高糖處理組（25 mmol／L葡萄糖）、甘露醇組（25 mmol／L甘露醇）、IL-35+高糖組（50 ng／mL IL-35+25mmol／L葡萄糖），每組設(shè)2個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24和48 h。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs凋亡率 收集“1.3.5”步驟中細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌 2次，2 000 r／min離心5 min，棄上清液。加適量1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105，然后加入5μL Annexin V-FITC及5μL PI-PE混勻，室溫避光15 min，再加入1×結(jié)合緩沖液400μL，立即上機檢測。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs VCAM-1表達(dá)100μL PBS緩沖液重懸“1.3.5”步驟中細(xì)胞，加入10μL FITC-鼠抗人VCAM-1，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，并用400μL PBS緩沖液重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs VCAM-1陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，性別比較采用χ2檢驗；正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，兩組比較采用t檢驗，3組比較采用單因素方差分析；偏態(tài)資料用中位數(shù)（M，25～75百分位數(shù)）表示，兩組數(shù)據(jù)比較用Mann-Whitney U檢驗，3組數(shù)據(jù)比較選用Kruskal-Wallis H檢驗；采用Spearman分析線性相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清IL-35及sVCAM-1濃度比較

與對照組相比，單純 T2DM組及 T2DM合并CAS患者血清IL-35濃度明顯降低，且T2DM合并CAS患者下降更為顯著。與對照組相比，單純T2DM組及T2DM合并CAS患者sVCAM-1濃度明顯升高，且T2DM合并CAS患者升高更為顯著。見表2。相關(guān)性分析表明，T2DM合并CAS患者血清IL-35和 sVCAM-1濃度呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.437 0，P＝0.009 8），見圖1。

表2 3組患者血清IL-35和sVCAM-1濃度比較

圖1 血清IL-35和sVCAM-1相關(guān)性分析

2.2 PBMCs中P35和 EBI3的mRNA表達(dá)

與對照組及單純 T2DM組相比，T2DM合并CAS組患者PBMCs中P35 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），且P35 mRNA表達(dá)水平與血清 IL-35濃度呈正相關(guān)（r＝0.436 5，P＝0.009 9）。3組患者EBI3 mRNA表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。見圖2-3。

圖2 各組患者P35及EBI3 mRNA水平比較

2.3 IL-35對高糖刺激后HUVECs凋亡率的影響

高糖刺激HUVECs 12 h后，低糖組與高糖組HUVECs凋亡率相比無明顯差異。高糖刺激24 h后，高糖組HUVECs凋亡率較低糖組明顯升高，且刺激48 h后HUVECs凋亡率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖3 P35 mRNA水平與IL-35濃度的相關(guān)性

圖4 高糖刺激后HUVECs的凋亡率

與高糖組相比，IL-35+高糖組在刺激24 h后HUVECs凋亡率無顯著變化，刺激48 h后凋亡率顯著下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 HUVECs經(jīng)IL-35刺激后的凋亡率

2.4 IL-35對高糖刺激后HUVECs VCAM-1表達(dá)的影響

在高糖刺激HUVECs 48 h后，高糖組VCAM-1陽性率 ［6.42%（0.25% ～10.34%）］較低糖組［3.56%（0.11% ～5.87%）］明顯升高（P＜0.05）。IL-35+高糖組 VCAM-1陽性率［3.73%（0.21% ～6.42%）］較高糖組明顯下降（P＜0.05）。見圖6。

圖6 IL-35刺激48 h后HUVECs中VCAM-1陽性率

3 討論

T2DM以高血糖、高脂血癥和胰腺細(xì)胞功能障礙為主要特征，占所有糖尿病病例的90% ～95%［7］。高血糖可激活許多血管活性和炎癥轉(zhuǎn)錄因子，如一氧化氮、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ、黏附分子和細(xì)胞因子，這些因素可引起白細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖，血管收縮、血管炎癥、血栓生成和AS形成，從而導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，與AS相關(guān)的大血管并發(fā)癥可導(dǎo)致心血管疾病和腦血管疾病的發(fā)生，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［8］。

IL-35是IL-12細(xì)胞因子家族中新確定的、具有抗炎性能的細(xì)胞因子，可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制CD4+效應(yīng)T細(xì)胞（Th1、Th2和Th17）和巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而抑制炎癥和免疫反應(yīng)［5］。有研究表明，在急性冠狀動脈綜合征患者血清中IL-35濃度降低，可能是由于大多數(shù)IL-35由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例在急性冠狀動脈綜合征患者血清中顯著降低［5］。本次研究表明，與對照組相比，單純T2DM組及T2DM合并CAS組患者血清IL-35濃度降低，且T2DM合并CAS組患者血清IL-35下降更明顯。

IL-35由α和β鏈的異源二聚體組成，即由亞基p35和EBI3組成［9-10］。本次研究發(fā)現(xiàn)T2DM合并CAS組患者P35 mRNA表達(dá)水平下降，且與血清IL-35濃度呈正相關(guān)。但EBI3 mRNA表達(dá)水平在3組間無顯著差異。這可能是因為IL-27是IL-12家族的一員，由EBI3和p28組成，與 IL-35共享亞基EBI3［11］，研究表明IL-27在內(nèi)皮細(xì)胞激活和早期斑塊形成過程中具有促AS的作用［12-14］。動物實驗表明EBI3缺陷的小鼠更易發(fā)生 AS［15］，IL-35抑制EBI3缺陷小鼠內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用不依賴于IL-27［8］。

糖尿病引起的高血糖嚴(yán)重?fù)p害與血液直接接觸的血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而損害血管舒縮功能和纖維蛋白溶解功能，加劇炎癥和氧化過程。近年來研究表明 IL-35在 AS［2］、炎癥性腸病［16］和敗血癥［8］等多種炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎效應(yīng)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清IL-35水平下降，經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后上調(diào)［17］。本研究通過體外高糖刺激HUVECs后，高糖組HUVECs凋亡率比低糖組明顯增加，IL-35作用后HUVECs凋亡率明顯下調(diào)；高糖組VCAM-1陽性率明顯高于低糖組，IL-35作用后VCAM-1陽性率明顯下調(diào)。表明IL-35可能通過抑制VCAM-1上調(diào)而發(fā)揮抑炎效能。

綜上所述，T2DM合并CAS患者血清IL-35濃度降低，血清sVCAM-1濃度升高。高糖條件下HUVECs凋亡率升高，VCAM-1陽性率上調(diào)，IL-35+高糖共培養(yǎng)時，HUVECs凋亡率下降，VCAM-1陽性率降低。因此，IL-35可能通過抑制VCAM-1表達(dá)在高糖引起的內(nèi)皮損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。調(diào)控IL-35可能是治療T2DM的有效治療手段。但I(xiàn)L-35在T2DM發(fā)病過程中的確切機制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究其在T2DM相關(guān)的AS性疾病過程中的信號傳導(dǎo)機制。