楊佩芳，丁小星，于駿，陳霞

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

我國女性宮頸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢［1］。宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌最多的病理類型，約占 80%以上［2］。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是磷脂激酶中的一個家族，是細胞應(yīng)答并且傳遞細胞間信號的重要協(xié)調(diào)者［3-4］。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，PI3K分為三類，包括Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。PIK3R1是Ⅰ類PI3K的調(diào)節(jié)亞基之一，編碼p85α蛋白。研究顯示，乳腺癌中存在p85α表達缺失，該缺失致PI3K活性增強，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［5］。p85α能夠直接與人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）相互作用，增強PTEN脂質(zhì)磷酸酶活性從而負向調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展，而PTEN基因的缺失、突變、甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其通過抑制磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，廣泛認(rèn)為是一種抑癌基因。但是，p85α蛋白在宮頸癌中的表達情況尚不清楚。因此，本研究通過檢測p85α蛋白及其編碼基因PIK3R1在宮頸鱗癌組織中的表達，探討其與宮頸鱗癌發(fā)病的關(guān)系，并檢測PTEN在宮頸鱗癌中的表達水平，分析PTEN與PIK3R1在宮頸鱗癌中的表達是否存在相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

38例宮頸鱗癌和39例良性宮頸石蠟包埋組織取自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理科。宮頸腫瘤病理類型由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師依據(jù)顯微鏡下宮頸組織形態(tài)確診。按照FIGO分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ+Ⅳ期（晚期）共10例。年齡34～82歲，平均年齡（55.47±12.22）歲。同時收集 2017年1月至12月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科門診行宮頸活檢術(shù)的新鮮宮頸（術(shù)后石蠟病理確診為宮頸鱗癌）組織標(biāo)本19例，患者年齡38～75歲，平均（54.11±10.80）歲；另選擇同期因子宮良性疾病行全子宮切除手術(shù)的良性宮頸組織19例，作為對照，患者年齡38～70歲，平均（47.21±7.16）歲。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有臨床標(biāo)本經(jīng)患者同意后獲取。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：石蠟病理切片確診為宮頸鱗癌；有至少2名經(jīng)驗豐富的婦瘤醫(yī)師評估得出準(zhǔn)確FIGO分期；病例排除標(biāo)準(zhǔn)：已接受過惡性宮頸腫瘤的治療（新輔助放療、化療）；有其他實體惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病的存在。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 手術(shù)切除的組織立即放置于冰上，生理鹽水沖洗去除血凝塊及宮頸黏液和分泌物，并于20 min內(nèi)送至本院中心實驗室-80℃保存。

1.2.2 組織HE染色 蠟塊切片，透明，置于梯度乙醇（濃度分別為95%、85%、75%）中各2 min，蒸餾水洗凈，蘇木精溶液染色10 min，流水沖洗1min；然后浸入1%鹽酸乙醇10～20 s，水洗1min，溫水藍化1 min，水洗2 min，切片置于75%乙醇中浸1min，伊紅染色1 min，置于梯度乙醇（濃度分別為85%和95%）中各1 min，100%乙醇脫水5 min，二甲苯透明，滴樹膠，封片，顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測p85α蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達

1.2.3.1 實驗步驟 蠟塊切片脫蠟，依次置于濃度分別為100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5 min；切片置于沸騰的枸櫞酸緩沖液中5 min行抗原修復(fù)，待其自然冷卻；Tween-20細胞通透，增加細胞通透性，減少背景著色；3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清滴于組織切片，濕盒常溫孵育25 min，封閉非特異性蛋白；滴加一抗（兔抗人p85α多克隆抗體1∶40），PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜；PBS沖洗、滴加二抗（羊抗兔IgG，即用型），室溫孵育25 min；PBS沖洗，DAB顯色，當(dāng)組織顏色變?yōu)榍煽肆由珪r加PBS溶液終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染2 min，流水沖洗；置于1%鹽酸乙醇中5 s，流水沖洗；溫水返藍5min，流水沖洗；脫水、二甲苯透明、封片、顯微鏡下進行觀察。其中，兔抗人多克隆抗體p85α、羊抗兔IgG聚合物均購于上海生工生物工程有限公司；DAB顯色液、Tween-20為福州邁新公司。

1.2.3.2 結(jié)果評定 組織陽性染色標(biāo)準(zhǔn)為細胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀或成片的巧克力樣著色。400×高倍鏡下隨機選取10個視野，觀察陽性細胞所占的比例，取平均值。根據(jù)著色細胞百分比及細胞著色深淺分別計分判定結(jié)果：陽性細胞百分比＜10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；細胞著色深淺：0分為不著色，1分為淺棕色，2分為棕黃色，3分為鐵銹色。兩項得分相乘即為總得分：＜3分為陰性，≥3分陽性。

1.2.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR） Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測總 RNA的 D（260 nm）／D（280 nm）值，并保證值為1.8～2.1。然后進行反轉(zhuǎn)錄，10μL體系中加入5×緩沖液 2μL，反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、寡核苷酸（50μmol／L）0.5μL，6核苷酸的隨機引物（100μmol／L）0.5μL，總 RNA為 500 ng／RNA濃度，不足部分加入無RNA酶水補充，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃恒溫。10μL的qRT-PCR總反應(yīng)體系中包括熒光染料混合液5μL，上、下游引物各 0.2μL，cDNA模板 0.4μL，其余部分用無RNA酶水補充。目的基因PIK3R1、PTEN及內(nèi)參GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及擴增長度見表1。反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，操作步驟按照試劑盒說明書進行，檢測儀器為Agilent Mx3000P（美國Stratagene公司）。

1.2.5 基因相對表達水平 實驗以GAPDH作為內(nèi)參照，采用相對定量方法進行分析，采用2-△△Ct的方法計算PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中的相對表達水平。

表1 引物序列及擴增長度

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0作圖進行分析，采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，p85α在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的陽性率采用卡方檢驗、PIK3R1和PTEN表達相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析、宮頸鱗癌組織中p85α的表達與各臨床參數(shù)的相關(guān)性采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織HE染色結(jié)果

良性宮頸由鱗狀上皮細胞、鱗柱狀上皮交接和柱狀上皮細胞組成，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，細胞核無增大且細胞無變形。宮頸鱗癌組織中，腫瘤未累及的宮頸鱗狀上皮細胞異型嚴(yán)重，甚至消失，見較多形態(tài)異常、染色加深的藍紫色細胞核，腫瘤累及的宮頸正常形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，由不同程度增生的異型腫瘤細胞取代，腫瘤細胞核增大、變形、分裂，細胞核染色變深，腫瘤細胞呈團塊狀聚集。見圖1。

圖1 良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織形態(tài)（HE染色×40）

2.2 p85α在宮頸鱗癌組織和良性宮頸組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，p85α蛋白在良性宮頸組織中高表達，主要表達于細胞質(zhì)中。p85α蛋白在宮頸復(fù)層鱗狀上皮的基底細胞中表達更多，在宮頸鱗癌細胞中表達較少，甚至不表達。見圖2。與良性宮頸組織相比，p85α在宮頸鱗癌組織中的表達顯著降低（t＝6.034，P＜0.01）。見圖3。

圖2 宮頸鱗癌組織和良性宮頸組織中p85α蛋白的表達

圖3 p85α蛋白在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達評分

p85α在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中分別有35例（89.7%，35／38）和 17例（44.7%，17／38）呈陽性表達，宮頸鱗癌組中p85α陽性表達率顯著低于良性宮頸組（χ2＝17.781，P＜0.01）。

2.3 p85α在宮頸鱗癌中的表達與各臨床參數(shù)的關(guān)系

p85α的表達與臨床病理分期及轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性（P＝0.001，0.016），病理分期越高，p85α表達越低；有遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中p85α表達較無遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤組織表達低；但尚不能表明其表達與年齡和分化程度有相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

表2 p85α在宮頸鱗癌組織中的表達與各臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4 PIK3R1和PTEN基因在宮頸鱗癌組織中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，與良性宮頸組織相比，PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中表達均明顯下調(diào)（PIK3R1 mRNA：t＝8.266；PTEN mRNA：t＝5.172，P均 ＜0.01）。見圖4。

圖4 PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中的表達

2.5 宮頸鱗癌組織中PIK3R1和PTEN表達相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，PIK3R1和PTEN兩者表達呈中等相關(guān)（r＝0.567，P＝0.011）。

3 討論

PI3K是一個復(fù)雜的大家族，其通過與細胞膜上的受體作用，介導(dǎo)外部信號傳遞入細胞內(nèi)部，進而影響細胞的增殖、存活和葡萄糖代謝等過程［6］。PI3K異常表達與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［7-8］，因此，近來PI3K廣泛用來作為潛在的腫瘤治療靶點。PIK3R1是Ⅰ類PI3K的調(diào)節(jié)亞基，共編碼3種蛋白，分別是p85α、p55α、p50α，其中，p85α蛋白結(jié)構(gòu)具有完整性。因此，p85α能夠直接與PTEN基因結(jié)合并增強PTEN脂質(zhì)磷酸酶活性［9］，從而抑制腫瘤的發(fā)展。

以往有研究顯示，p85α在實體惡性腫瘤中表達下調(diào)，本實驗結(jié)果顯示，p85α在宮頸鱗癌組織中顯著下調(diào)，且隨分期升高表達越低；此外，p85α在轉(zhuǎn)移宮頸鱗癌組織中較無轉(zhuǎn)移宮頸鱗癌組織表達更低，由此表明，p85α低表達在宮頸侵襲的過程中可能發(fā)揮負面作用。研究報道，PIK3R1在多種實體惡性腫瘤中表達下調(diào)，通過抑制腫瘤細胞的生長發(fā)揮抑癌基因的作用［10］，也有研究發(fā)現(xiàn)PIK3R1減少的程度與腫瘤的分期及預(yù)后顯著相關(guān)［11］，這些研究表明PIK3R1在一些腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。本實驗結(jié)果顯示，與良性宮頸組織相比，PIK3R1在宮頸鱗癌中的表達水平顯著降低，可能在宮頸鱗癌的發(fā)生過程中發(fā)揮負面作用。

研究發(fā)現(xiàn)，PTEN能夠抑制PI3K的活性，其作為磷酸酯酶將磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），致PI3K的產(chǎn)物減少，通過負調(diào)節(jié)PI3K的信號傳導(dǎo)過程，抑制PI3K通路的異常活化。本實驗通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PIK3R1與PTEN在宮頸鱗癌中的表達呈中等相關(guān)，但兩者是否通過相關(guān)途徑發(fā)揮作用，還需后續(xù)深入研究。

宮頸鱗癌組織中p85α及其編碼基因PIK3R1表達均顯著降低，且p85α表達與腫瘤的進展與侵襲相關(guān)，因此，我們認(rèn)為p85α的缺失可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生，并且PIK3R1可能與PTEN相互作用，共同發(fā)揮抑癌基因的角色，具體作用機制還有待進一步研究。