石鍵，周武碧

（南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院1.檢驗科，2.病理科，江蘇淮安223300）

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類新發(fā)現的具有有限或無蛋白質編碼能力的 RNA，長度為200 nt～100 kb［1-4］。lncRNAs在染色體失活、細胞分化、基因組印跡和細胞增殖等多種生物學過程中起重要的調控作用［5-6］。長鏈非編碼RNA-卵巢癌相關1（long non-coding RNA-ovarian cancer associated 1，Lnc-OC1）在卵巢癌組織中呈高表達，其促進卵巢癌細胞的增殖和轉移，且與卵巢癌患者的不良預后相關［7］。miRNAs是一類約22 nt的非編碼RNA，通過結合mRNA調控其翻譯和降解［8-9］，其中，miR-34在結直腸癌的進展中起重要作用。研究發(fā)現，miR-34在結直腸癌中呈低表達［10］，其可以抑制結直腸癌遷移和增殖，并且能夠提高結腸癌細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性［11-13］。Lnc-OC1在結直腸癌中的作用尚不完全清楚，因此，本研究采用實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測Lnc-OC1與miR-34在結直腸組織及癌旁組織中的表達及相關性，探討Lnc-OC1對結直腸癌遷移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

包含80例結直腸癌組織和15例癌旁組織的cDNA芯片為上海芯超生物科技有限公司產品，產品編號為cDNA-HColA095Su02，包含完整的臨床病理資料和隨訪資料；患者手術時間為2006年2月至2010年2月，隨訪時間至2015年9月，隨訪5～9年，死亡44例，患者術前均未經過放射治療和化學治療。

1.2 儀器與試劑

RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；CFX96 PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 qRT-PCR檢測Lnc-OC1和miR-34表達

采用試劑盒檢測Lnc-OC1和miR-34的表達，其中，GAPDH為Lnc-OC1內參，18 S rRNA為miR-34內參。RT-PCR引物序列如下，Lnc-OC1上游引物為5′-GGCCTGTGTGTTGAATGCTG-3′，下游引物為 5′-CTGTGGTCACAAAGGCCTGA-3′；miR-34上游引物為 5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′，下 游 引物為 5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′；內 參GAPDH上游引物為5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物為 5′-TTGGAGGGATCTCGCTCCT-3′；18 S rRNA上游引物為 5′-CGGCTACCACATCCTATGAA-3′，下游引物為 5′-TGGAGCTGGAATTACCGCGG-3′。PCR反應體系共 20μL，其中，熒光混合物10μL，10μmol／L上游引物和下游引物各1 μL，50×ROX染料Ⅱ 0.5μL、cDNA模板 1μL，雙蒸水6.5μL。上述反應均在冰上進行。反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火，延伸30 s，共35個循環(huán)。通過公式2-△△Ct計算相對表達量。每組實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 結直腸癌組織中Lnc-OC1和miR-34的表達及其與臨床病理參數間的關系

結直腸癌組織中Lnc-OC1的表達水平（0.70±0.12）明顯高于癌旁組織（0.36±0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（t＝19.315，P＜0.001）；結直腸癌組織中miR-34的表達水平（0.61±0.18）明顯低于癌旁組織（0.91±0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（t＝12.507，P＜0.001）。Lnc-OC1與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化無相關性（P＞0.05），而與淋巴結轉移、TNM分期相關（P＜0.05）。見表1。

2.2 結直腸癌組織中Lnc-OC1與miR-34間的相關性

相關性結果顯示，結直腸癌組織中Lnc-OC1的相對表達水平與 miR-34表達呈負相關（r＝-0.967，P＜0.001）。見圖1。

表1 腫瘤組織中Lnc-OC1的表達與臨床病理參數間的關系

圖1 結直腸癌組織中Lnc-OC1與miR-34表達間的相關性

2.3 結直腸癌組織中Lnc-OC1表達與患者預后的關系

生存分析結果表明，Lnc-OC1高表達患者的總體生存率（8／40）低于 Lnc-OC1低表達患者（28／40，χ2＝19.72，P＜0.001）。多因素 Cox回歸分析結果表明，結直腸癌組織中Lnc-OC1的表達是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素（P＜0.01）。見表2。

圖2 直腸癌患者Lnc-OC1不同表達水平的Kap lan-M eier生存曲線

表2 結直腸癌患者預后因素的單因素和多因素分析

3 討論

研究報道，Lnc-OC1在卵巢癌中高表達且可促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和轉移，Lnc-OC1高表達的卵巢癌患者總體生存率較Lnc-OC1低表達者明顯降低［7］。本研究結果顯示，Lnc-OC1在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，表明Lnc-OC1可能參與結直腸癌的發(fā)生，其高表達可能導致結直腸癌組織上皮過度增殖或突變，從而形成腫瘤。Lnc-OC1與結直腸癌淋巴結轉移相關，而且TNM分期越高，結直腸癌組織中Lnc-OC1表達越高，提示Lnc-OC1與結直腸癌的發(fā)展密切相關，在結直腸癌中可能也促進癌細胞遷移。此外，Lnc-OC1高表達的結直腸癌患者總體生存率較Lnc-OC1低表達患者明顯降低。結直腸癌組織中Lnc-OC1高表達是患者總體生存率的獨立危險因素，提示Lnc-OC1在結直腸癌中同樣可以作為預后標志物，其高表達提示結直腸癌患者預后不良。

miR-34在多種腫瘤如胃癌、肺癌、胰腺癌和急性淋巴細胞白血病中低表達［14-17］，其在多種類型腫瘤中具有強抑癌作用［18］。本研究結果顯示，miR-34在結直腸癌組織中呈低表達，且Lnc-OC1表達與miR-34表達呈負相關，由此推測Lnc-OC1可能通過抑制miR-34表達從而促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，但是結直腸癌中兩者是否存在調控關系需要進一步實驗驗證。

綜上，Lnc-OC1在結直腸癌組織中呈高表達，可促進結直腸癌細胞遷移，其可作為結直腸癌患者潛在的預后標志物。