鈕婧歆，郭晶，郭青，李杰，劉珺，*，劉朝暉，*

（1.蘇州大學醫(yī)學部人體解剖與組織胚胎學系，江蘇蘇州215123；2.連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學?；A醫(yī)學教研室，江蘇連云港222007；3.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學教研室，江蘇蘇州215009）

帕金森病是一種常見的神經退行性疾病，常染色體顯性基因富亮氨酸重復激酶2（leucine rich repeat kinase 2，LRRK2）基因突變是其發(fā)病的主要原因。LRRK2基因突變后導致黑質致密部多巴胺能神經元丟失和神經元內路易氏小體沉積。以往研究表明，由遺傳性突變LRRK2結構域第2019位點氨基酸殘基G2019S突變（LRRK2-G2019S）引起的激酶活性增強是導致多巴胺能神經元損傷的重要機制［1］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是一種可穿越血腦屏障的中藥單體，能有效保護腦組織，抑制6-羥多巴胺誘導的神經細胞死亡［2］，還能抑制帕金森病神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）引起的 αsyn聚集和多巴胺能神經元損傷［3］。此外，EGCG還具有非常強的抗氧化活性［4］。氧化應激是帕金森病發(fā)病的重要原因［5］，由此推測EGCG對多巴胺能神經元的保護作用可能與其抗氧化活性有關。體內外實驗均表明，蛋白激酶C信號通路與LRRK2激酶活性密切相關［6］。EGCG對蛋白激酶C信號通路有抑制作用，但其對LRRK2激酶活性是否具有抑制作用尚不清楚。本研究擬探討EGCG對LRRK2激酶活性的作用及其對果蠅生物學行為的影響和相關分子信號機制。

1 材料與方法

1.1 材料

UAS-LRRK2-G2019S品系果蠅為約翰霍普金斯大學Wanli Smith教授實驗室贈送，通過和GAL4雜交獲得 Ddc-Gal4／LRRK2-G2019S品系果蠅（簡稱Ddc-G2019S）。EGCG（上海源葉生物科技有限公司）；LRRK2激酶抑制劑GW5074（美國APExBIO公司）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）抗氧化劑（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單抗（美國 Sigma公司）；兔抗p-LRRK2單克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗核因子E2相關因子2（Nrf2）單克隆抗體（美國 Aviva Systems Biology公司）；小鼠抗 β-微管蛋白單克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK單克隆抗體、兔抗p-ERK單克隆抗體（蘇州睿瀛生物技術有限公司）；小鼠抗TH單克隆抗體（Millipore公司）。

1.2 果蠅培養(yǎng)基的配制

先配制果蠅標準玉米培養(yǎng)基，用于Ddc-G2019S對照組果蠅培養(yǎng)；再取適量加入不同藥物，配成不同加藥組果蠅培養(yǎng)基。具體操作：①稱取瓊脂3.3 g，蔗糖25 g放入盛有300 mL冷水的燒杯中，完全溶解后置于加熱磁力攪拌器上；②稱取酵母12 g放入上述燒杯中，完全溶解后加入玉米粉30 g，攪拌均勻；③待溶液沸騰5 min后停止加熱；④待溫度降至75℃左右時，加入尼泊金甲酯溶液3 mL，丙酸1.5 mL，攪拌均勻；⑤ 溫度降至適宜時取一部分灌裝果蠅食物管，此為果蠅標準玉米培養(yǎng)基；⑥ 取50 mL培養(yǎng)基 6份，分別加入 10 mmol／L GW5074，10mmol／LNAC，100μmol／L EGCG，1、10和100mmol／L EGCG各50μL，混勻，灌裝果蠅食物管，即為加藥培養(yǎng)基，藥物濃度分別為10μmol／L GW5074，10μmol／L NAC，0.1、1、10和 100μmol／L EGCG。

1.3 實驗分組

將Ddc-G2019S果蠅分為7組：對照組采用標準玉米培養(yǎng)基飼養(yǎng)；GW5074組采用含 10μmol／L GW5074的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；NAC組采用含10μmol／L NAC的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；其余4組分別采用含0.1、1、10和100μmol／L EGCG的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；每組各6管，共42管；每管置入處女蠅25只，于25℃，相對濕度60%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.4 果蠅生命周期及行為學檢測

各實驗組每管置入處女蠅25只，每組至少2管果蠅，每隔2天換1次培養(yǎng)基。每天統計果蠅存活數，直至果蠅全部死亡。

待處女蠅發(fā)育成熟后，開始每周1次行為學檢測，檢測果蠅運動能力。成熟果蠅有沿行為學測試管管壁向上攀爬的生物學特性，以10 s內越過測試管中線的果蠅數量占管內果蠅總數的百分率來表示果蠅運動能力，數值越高表明整組果蠅運動能力越強。具體操作：在未麻醉情況下，將各組的每管果蠅分別轉移至另一空培養(yǎng)管中，靜置2～3 min，使之適應環(huán)境改變；輕拍管壁使之全部落在管底，統計10 s內爬過行為學測試管中線的果蠅數量；取3次實驗平均值，每兩次實驗間隔5 min。

1.5 蛋白質印跡法檢測果蠅腦蛋白的表達

依據果蠅生命周期和行為學檢測結果，篩選出10μmol／L EGCG組，1μmol／L EGCG組，10μmol／L GW5074組，10μmol／L NAC組，與對照組進行比較。在藥效最顯著的時間段，取各組果蠅腦組織，分析各種蛋白的表達。具體操作如下。

CO2麻醉后，在顯微鏡下，用尖頭鑷和刀片取果蠅腦組織，每組取4個，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上研磨，靜置裂解30 min；4°C，12 000 r／min離心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，調整上樣量，使各組蛋白總量一致；加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使蛋白質變性。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

制備分離膠、濃縮膠，行SDS-PAGE分離蛋白；轉至PVDF膜；室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h；將PVDF膜按一抗蛋白分子量剪開放入對應的一抗稀釋液中（p-LRRK2，Nrf2，p-ERK1／2，p-p38 MAPK，TH稀釋比均為1∶800，β-微管蛋白稀釋比為1∶1 000，TBST為抗體稀釋液），4℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3次；加入二抗（稀釋比均為1∶2 000），室溫孵育2 h；洗膜后在暗室中加入發(fā)光劑，成像系統顯影。采用Image J軟件處結果圖像。

1.6 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖并用單因素方差分析和Bonferroni事后檢驗法進行統計學分析。實驗結果以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組果蠅生命周期比較

與對照組相比，各組果蠅存活率從第3周開始出現差異，第4周差異進一步擴大，第5周時各組存活率出現較大下降。與對照組相比，10μmol／L EGCG組提高存活率效果始終最明顯，與GW5074組相近，且在第 5、6、7周優(yōu)于 GW5074；1μmol／L EGCG組效果相對較好，但第6、7周效果明顯下降。與對照組相比，NAC組果蠅存活率提高，總體作用雖不如GW5074組和10μmol／L EGCG組，但在第 6、7周表現較好；100μmol／L EGCG和 0.1 μmol／L EGCG對果蠅有一定保護作用，但效果不及其余4組，與對照組差異始終不明顯。見圖1。

與對照組相比，GW5074組、10μmol／L EGCG組和1μmol／L EGCG組半數生存時間明顯延長（P＜0.01），NAC組、100μmol／L EGCG組和 0.1 μmol／L EGCG組半數生存時間有一定延長（P＜0.05）。進一步印證選用10μmol／L和1μmol／L的EGCG延長果蠅壽命效果較好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明顯。見圖1。

圖1 果蠅的生命周期檢測結果

2.2 果蠅行為學的變化

由圖2可見，7組果蠅運動能力在第5周發(fā)生較大變化。與對照組相比，10μmol／L EGCG組、1 μmol／L EGCG組與 GW5074組第 4、5、6、7周運動能力均明顯提高（P＜0.05），第5周時最明顯（P＜0.01）；NAC組在第 4、5、6周運動能力也有不同程度的提高（P＜0.05），第5周時最明顯（P＜0.01）；0.1μmol／L EGCG組僅在第4周時差異有統計學意義（P＜0.05）；100μmol／L EGCG組與對照組相比，差異均無統計學意義。

結果表明，與對照組相比，10μmol／L EGCG改善果蠅運動能力的效果最為突出，1μmol／L EGCG效果較好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明顯，各組果蠅第5周時行為學變化最顯著。

圖2 果蠅運動能力檢測結果

2.3 EGCG作用后果蠅腦內蛋白表達的變化

由圖3可見，與對照組相比，10μmol／L和1 μmol／L EGCG組果蠅腦內 Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表達均明顯增加（P＜0.05或0.01），p-LRRK2、p-p38 MAPK蛋白表達明顯降低（P＜0.05或0.01）。與對照組相比，GW5074組和NAC組果蠅腦內p-ERK1／2、TH蛋白表達明顯上調（P＜0.05或0.01），GW5074組 p-LRRK2和 p-p38 MAPK蛋白表達明顯下調（P＜0.01）。NAC組Nrf2表達明顯增加（P＜0.01），兩種濃度的EGCG均能促進Nrf2表達，而1μmol／L EGCG作用效果更佳，低濃度EGCG促進Nrf2表達的作用更強，表明EGCG具有很強的抗氧化活性。GW 5074沒有明顯的抗氧化作用。

3 討論

本研究采用人源性LRRK2-G2019S突變轉基因果蠅，其腦內LRRK2激酶活性增高，是探究EGCG是否具有抑制LRRK2激酶活性作用的良好模型。本研究表明，EGCG能顯著延長LRRK2-G2019S轉基因果蠅壽命，改善果蠅運動能力，以10μmol／L作用效果最顯著，1μmol／L效果較好；各組果蠅第5周時行為學變化最顯著；此外，EGCG能增加果蠅腦內 Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表達，降低 p-LRRK2、pp38 MAPK表達，表明EGCG能有效抑制LRRK2激酶活性，有較好的抗氧化活性，進而保護多巴胺能神經元；其機制可能與Keap1-Nrf2-ARE和MAPK信號通路有關。在Keap1-Nrf2-ARE信號通路中，EGCG通過激活Nrf2，引起Nrf2核轉移，繼而提高谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）基因表達，增加谷胱甘肽合成［7］，產生抗氧化作用，從而提高Ddc-G2019S轉基因果蠅腦內多巴胺能神經元的抗氧化應激能力［8］；在MAPK信號通路中，EGCG通過抑制p38磷酸化和（或）激活ERK1／2抑制細胞凋亡，進而保護多巴胺能神經元。

在哺乳動物中，有4個MAPK信號途徑與帕金森病有關，分別是 ERK1／2，p38 MAPK，JNK及ERK5［9］。p38 MAPK、JNK與 LRRK2也有相關性，但是三者與帕金森病之間的關系尚不明確。在應激狀態(tài)下，LRRK2可激活p38 MAPK和MKK7參與JNK信號途徑，導致細胞凋亡［10］。ERK1／2參與LRRK2突變引起的神經退化的信號途徑［11］。有研究報道，EGCG對MAPK通路也具調節(jié)作用，可能通過干預體內p38 MAPK信號通路抑制脂多糖誘導巨噬細胞表達TNF-α［12］。本研究結果顯示，與對照組相比，EGCG組p-LRRK2表達明顯降低，表明其對LRRK2激酶活性具有抑制作用；同時，EGCG組p-ERK1／2、p-p38 MAPK表達明顯增加，由此提示，EGCG可能通過降低LRRK2突變導致的激酶活性，間接調控p38 MAPK的磷酸化或活化ERK，進而對多巴胺能神經元起到保護作用。

本研究結果顯示，EGCG也能同時增加果蠅腦內Nrf2和TH表達量。Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，受Keap1調控，通過與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相互作用調節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶表達［13］。Keap1-Nrf2-ARE信號通路是機體抗氧化機制中最重要的一條信號通路［14］。GCLC是 Nrf2調控的下游抗氧化酶［15］，經 Nrf2轉錄調節(jié)促進谷胱甘肽的合成［7］。現已證實，帕金森病患者黑質中谷胱甘肽減少約50%，從而致多巴胺能神經元易受到多種毒性物質的損傷［8］。研究表明，EGCG可通過誘導 GCLC基因表達提高肝星狀細胞胞質和線粒體谷胱甘肽的水平［16］。本研究結果顯示，與對照組相比，EGCG組果蠅腦內Nrf2表達增加，提示EGCG可能通過激活Nrf2，引起其核轉移，繼而上調GCLC基因表達，增加果蠅腦內谷胱甘肽的合成，增強細胞抗氧化應激能力，從而保護多巴胺能神經元免受帕金森病誘導刺激的影響，但具體作用機制還有待進一步研究。

圖3 各組果蠅腦內相關蛋白的表達

本研究中，EGCG對LRRK2激酶活性抑制作用雖稍弱于GW5074，但其本身還具有很強的抗氧化活性，雙重作用使EGCG較GW5074更具有作為帕金森病治療藥物的潛力。EGCG作為一種中藥單體是天然提取的化合物，來源廣，安全性高，具有很大的市場價值。目前關于EGCG產生LRRK2激酶活性抑制作用的信號通路研究并不完善，還有待于后續(xù)研究進一步探索。本實驗室已培育了一批LRRK2-G2019S系轉基因小鼠，將藥物用于轉基因小鼠的生物學研究，聯合應用果蠅與小鼠，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，能更好地指導臨床藥物選擇，同時也為中草藥制劑的治療作用機制添加更多科學、客觀的實驗資料。

綜上所述，EGCG是一種有效的LRRK2激酶活性抑制劑，具有多巴胺能神經元保護作用，可能與其調控Keap1-Nrf2-ARE、MAPK等信號傳遞有關。