張巍，林江，陳巧云，錢震，克曉燕，錢軍

（1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002；3.北京大學第三醫(yī)院血液內(nèi)科，北京100191）

T細胞活化需要雙信號系統(tǒng)：第一信號為“抗原肽—主要組織相容性復合體—T細胞抗原受體”構成的抗原特異性識別信號；第二信號為協(xié)同刺激信號，主要由抗原遞呈細胞表面的B7共刺激分子和CD28分子介導。目前已發(fā)現(xiàn)十余個B7家族成員，在淋巴和非淋巴器官均有表達，與相應受體結合通過調(diào)節(jié)T細胞從而參與抗腫瘤免疫；一些負性共刺激分子在人類多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的生物學特性及患者預后密切相關，還可通過非免疫調(diào)控作用直接參與腫瘤形成［1-2］。多種腫瘤細胞通過下調(diào)胞膜HLA-Ⅰ類分子表達，減弱CD8+T細胞識別腫瘤的能力；通過下調(diào)胞膜HLA-Ⅱ類分子表達，削弱CD4+T細胞吞噬腫瘤細胞或內(nèi)化抗原肽的能力，實現(xiàn)免疫逃逸［3］。然而，B7家族分子、HLA抗原在惡性血液病中的表達特征及意義尚未完全闡明，不同類型血液腫瘤中具體何種B7分子可作為其分子靶標尚不清楚。因此，本研究選取13種人類惡性血液病細胞株并以12例健康志愿者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）作為對照，采用流式細胞術檢測 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子，B7-H1、CD279、B7-H3和 B7-H4膜蛋白表達以及B7-H1、B7-H3和B7-H4等胞質(zhì)和（或）胞核蛋白表達，為進一步研究B7分子在惡性血液病中的作用及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

澳洲胎牛血清（美國 HyClone公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM（美國Gibco公司）；PE標記抗人B7.1單克隆抗體（克隆 L307.4）、FITC標記抗人B7.2單克隆抗體［克隆2331（FUN-1）］、FITC標記抗人HLA-Ⅰ單克隆抗體（克隆G46-2.6）、APC標記抗人HLA-Ⅱ單克隆抗體（克隆G46-6）、PE標記抗人B7-H1單克隆抗體（克隆MIH1）和相應同型對照抗體（美國BD公司）；APC標記抗人CD279單克隆抗體（克隆J105）、APC標記抗人B7-H3單克隆抗體（克隆7-517）、PE標記抗人B7-H4單克隆抗體（克隆H74）和相應同型對照抗體（美國eBioscience公司）。固定破膜試劑盒BD IntraSureTM試劑盒（美國BD公司），固定破膜試劑盒Foxp3／轉錄因子染色緩沖液試劑盒（美國eBioscience公司）。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞株、人急性單核細胞白血病U937細胞株、人慢性髓系白血病K562細胞株、人Burkitt淋巴瘤Raji和CA46細胞株、Maver和Z138（人套細胞淋巴瘤細胞株）、Jurkat、JurkatE6-1和 Molt-4（人 T淋巴母細胞白血?。馨土黾毎辏?、Hut-78（人皮膚T細胞淋巴瘤細胞株）和YTS（人NK／T細胞淋巴瘤細胞株）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）。人多發(fā)性骨髓瘤CZ1細胞株由上海長征醫(yī)院惠贈。

HL-60、U937、K562、Raji、Z138、Jurkat、Jurkat E6-1、Molt-4、和CZ1細胞株分別于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）中培養(yǎng)。CA46、Hut-78和 YTS細胞株分別于RPMI-1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）中培養(yǎng)。Maver培養(yǎng)于IMDM中（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）。上述細胞株均在37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液及傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 健康體檢者血樣的采集與處理

本研究分別經(jīng)江蘇大學附屬人民醫(yī)院和北京大學第三醫(yī)院倫理委員會審批通過。簽訂知情同意書后，分別抽取12例健康志愿者空腹肘前靜脈血進行檢測。志愿者中男女各6例，年齡19～40歲，均無血液、心、肝、腎、消化、神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病和代謝異常等病史，無近期手術史，采血前1個月內(nèi)及采血期間未服用任何藥物，采血期間禁煙、酒及含咖啡因飲料，于北京大學第三醫(yī)院體檢中心進行常規(guī)健康體檢均合格。

血樣的處理：采集上述志愿者肝素抗凝外周血4 mL，加入4 mL PBS混勻，將稀釋后血液緩慢加至8 mL人淋巴細胞分離液面上，400×g離心20 min，吸取單個核細胞層，PBS洗滌后重懸備用。

1.4 流式細胞術檢測B7共刺激分子的表達及亞細胞定位

1.4.1 B7分子和HLA抗原膜蛋白水平檢測 分別取12例健康志愿者PBMCs和13株人類惡性血液病細胞，用預冷PBS洗滌2次后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106／mL。分別加入20μL B7.1、20μL B7.2、20μLHLA-Ⅰ、20μLHLA-Ⅱ、20 μL B7-H1、5μL CD279、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細胞儀檢測，計算表達率和相對表達，相對表達以平均熒光強度（MFI）計算，陽性表達分：“++”，即lg目的分子MFI值／lg同型對照MFI值≥2；“+”，即lg目的分子MFI值／lg同型對照MFI值＜2。實驗至少重復3次。

1.4.2 3種負性B7分子胞質(zhì)蛋白水平檢測 應用BD公司固定破膜試劑盒，將上述單細胞懸液分別加入100μL破膜劑A液，室溫避光孵育5min；鞘液洗滌1次后，加入50μL破膜劑B液，再分別加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細胞儀檢測，計算表達率。實驗至少重復3次。

1.4.3 3種負性B7分子胞核及胞質(zhì)蛋白水平檢測應用eBioscience公司固定破膜試劑盒，將上述單細胞懸液分別加入1 mL破膜劑工作液（固定／破膜濃縮液與固定／破膜稀釋液以1∶3比例混合），室溫避光孵育30 min；再加入1 mL破膜緩沖液工作液（10×破膜緩沖液以1∶10比例稀釋），室溫避光孵育20 min。離心后鞘液重懸細胞，分別加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細胞儀檢測，計算表達率。實驗至少重復3次。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩相互比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人類惡性血液病細胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達

結果顯示（圖1、表1），12例健康受試者 PBMCs中，中性粒細胞（PBN）、單核細胞（PB Mo）、淋巴細胞（PB L）均不表達B7.1；大部分單核細胞和小比例PB N表達B7.2，相對表達偏低；除PBN不表達HLA-Ⅱ類分子外，PBMCs均表達HLA抗原，其中HLA-Ⅰ類分子的相對表達明顯較高。人類惡性血液病細胞株中，B7.1在急性髓系白血?。℉L-60和U937）和T細胞白血?。馨土黾毎胁槐磉_或低表達，在 B細胞淋巴瘤 （Raji、CA46、Maver和Z138）、CZ1和 K562中表達豐度較高；B7.2除在髓系白血?。║937和K562）中低表達、T淋巴母細胞白血?。馨土鲋胁槐磉_外，其余細胞中均表達或高表達；HLA抗原在多數(shù)細胞中表達率和相對表達均較高，以HLA-Ⅰ類分子最顯著（僅K562不表達）；HLA-Ⅱ類分子在U937和HL-60中近半數(shù)表達而相對表達偏低，在K562以及T淋巴母細胞白血?。馨土黾毎胁槐磉_，其余細胞均高表達。

圖1 人類惡性血液病細胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達

對同一腫瘤來源的細胞株而言，4種分子膜蛋白在3株T淋巴母細胞白血?。馨土黾毎小LA抗原在4株B細胞淋巴瘤細胞中表達均一致。而B7.1和B7.2在B細胞淋巴瘤細胞株中存在差異：在Burkitt淋巴瘤來源的Raji中，兩種分子表達均較CA46明顯升高（t＝22.163，P＝0.000和 t＝3.055，0.038）；套細胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，B7.1在 Maver中表達較高（t＝5.978，P＝0.004），B7.2則在 Z138中表達較高（t＝-29.968，P＝0.000）。

2.2 人類惡性血液病細胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表達

結果顯示（圖2、表2），12例健康受試者中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞均不表達B7-H1及其受體CD279、B7-H3和B7-H4。4種分子的膜蛋白僅在少數(shù)惡性血液病細胞株中表達：B7-H1僅在Hut-78和Maver中有極低水平表達，其余細胞均不表達。CD279在YTS、套細胞淋巴瘤中表達率和相對表達均較高，在CZ1和Hut-78中分別檢測到高和低表達、但相對表達偏低，其余細胞則不表達。B7-H3的表達率在U937中最高，Maver和Z138中較高，K562和Hut-78中較低；相對表達則在U937和Maver中明顯較高、在Z138、K562和Hut-78中偏低，其余細胞則不表達。B7-H4僅在HL-60細胞中檢測到低水平表達，其余細胞均不表達。

表1 人類惡性血液病細胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達±s，%

表1 人類惡性血液病細胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達±s，%

B7.1 B7.2 HLA-ⅠHLA-Ⅱ表達率 相對表達 表達率 相對表達 表達率 相對表達 表達率 相對表達中性粒細胞 0.17±0.13 - 11.06±1.68 + 99.96±0.04 ++ 0.62±0細胞株.11 -單核細胞 0.30±0.05 - 88.47±1.42 + 99.87±0.06 ++ 97.07±0.25 ++淋巴細胞 1.07±0.12 - 0.56±0.04 - 99.94±0.06 ++ 46.76±1.50 +HL-60 0.16±0.22 - 82.97±2.13 ++ 99.85±0.13 ++ 43.90±2.22 +U937 0.16±0.15 - 12.32±2.35 + 99.90±0.01 ++ 55.83±5.15 +K562 28.79±2.22 + 11.22±0.30 + 0.62±0.06 - 0.70±0.03 -Raji 88.42±2.73 ++ 88.81±1.37 ++ 96.14±1.31 ++ 99.62±0.36 ++CA46 27.07±3.94 + 68.94±11.19 ++ 100.00±0.00 ++ 99.95±0.04 ++Maver 78.94±8.69 ++ 22.46±3.09 + 99.92±0.06 ++ 97.57±2.17 ++Z138 41.48±6.48 + 80.15±1.26 + 99.99±0.00 ++ 93.84±5.35 ++Jurkat 0.89±1.74 - 3.82±1.90 - 99.57±0.08 ++ 1.11±0.40 -JurkatE6-1 0.67±0.94 - 6.07±3.05 - 99.77±0.23 ++ 1.72±2.37 -Molt-4 0.13±0.05 - 1.98±1.95 - 99.32±0.29 ++ 0.46±0.28 -Hut-78 10.82±4.41 + 87.25±4.18 + 97.66±2.33 ++ 99.39±0.60 ++YTS 1.03±0.38 - 25.70±2.89 + 99.55±0.15 ++ 99.89±0.07 ++CZ1 46.41±4.59 + 96.18±0.59 ++ 74.70±4.47 + 99.76±0.09 ++

圖2 人類惡性血液病細胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表達

表2 人類惡性血液病細胞株中負性B7相關分子膜蛋白的表達±s，%

表2 人類惡性血液病細胞株中負性B7相關分子膜蛋白的表達±s，%

B7-H1 CD279 B7-H3 B7-H4表達率 相對表達 表達率 相對表達 表達率 相對表達 表達率 相對表達中性粒細胞 1.62±0.25 - 2.83±1.74 - 0.46±0.20 - 1.01±0.84細胞株-單核細胞 0.91±0.13 - 3.93±1.25 - 0.64±0.55 - 1.69±0.72 -淋巴細胞 0.44±0.09 - 5.44±2.52 - 0.23±0.11 - 0.25±0.39 -HL-60 0.19±0.27 - 0.90±0.81 - 0.28±0.30 - 11.92±2.52 +U937 0.23±0.23 - 4.35±2.04 - 95.08±4.12 ++ 2.30±1.26 -K562 0.39±0.02 - 4.96±0.22 - 12.58±2.47 + 2.04±0.31 -Raji 0.36±0.17 - 0.09±0.05 - 1.32±0.47 - 0.70±0.32 -CA46 0.21±0.19 - 1.23±1.22 - 0.12±0.16 - 3.47±1.15 -Maver 6.15±1.29 + 95.89±2.76 ++ 87.46±8.99 ++ 2.02±1.02 -Z138 0.48±0.15 - 90.19±3.76 ++ 80.47±6.12 + 2.38±0.85 -Jurkat 0.33±0.50 - 1.15±0.53 - 0.19±0.16 - 1.23±0.26 -JurkatE6-1 4.16±1.57 - 4.67±2.59 - 1.25±1.73 - 1.74±1.43 -Molt-4 4.73±1.03 - 5.21±2.74 - 0.05±0.04 - 1.42±0.66 -Hut-78 6.81±1.51 + 12.19±6.09 + 10.50±2.82 + 1.18±1.25 -YTS 1.22±0.36 - 98.19±0.13 ++ 1.85±0.82 - 1.67±0.43 -CZ1 0.48±0.27 - 77.25±1.98 + 0.00±0.00 - 0.63±0.42-

2.3 人類惡性血液病細胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞質(zhì)和（或）胞核蛋白的表達

結果顯示（圖3），12例健康受試者中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞均不表達3種分子。應用BD公司固定破膜試劑盒檢測胞質(zhì)蛋白，結果顯示僅在U937、Z138和Maver細胞中有低水平 B7-H3表達，其余細胞均不表達3種分子的胞質(zhì)蛋白。應用eBioscience公司固定破膜試劑盒檢測胞核及胞質(zhì)蛋白，發(fā)現(xiàn)B7-H1在細胞株中均有偏低比例表達，其中 U937、Molt-4和 CA46的表達豐度較高。B7-H3除在CZ1中不表達外，其余12株細胞中均可檢測出偏低比例表達，其中Z138和Maver的表達豐度較高。B7-H4在除CZ1外的12株細胞中異常高表達或表達，其中 Raji和 HL-60表達豐度最高，Molt-4、Hut-78、Jurkat和 JurkatE6-1表達居中。

圖3 人類惡性血液病細胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞質(zhì)和（或）胞核蛋白的表達

同一腫瘤來源的細胞株中，3種負性B7分子的胞核及胞質(zhì)蛋白表達亦存在差異：Burkitt淋巴瘤來源的Raji和CA46相比，B7-H1在CA46中表達較高（t＝-5.685，P＝0.005），B7-H3表達無明顯差別（t＝1.761，P＞0.05），B7-H4則在 Raji中表達較高（t＝11.655，P＝0.000）。套細胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，B7-H1在Z138中表達較高（t＝-3.249，P＝0.031），而 B7-H3和 B7-H4表達未見明顯差異（t＝-2.710，1.736，P均 ＞0.05）。T淋巴母細胞白血病／淋巴瘤來源的Molt-4中，B7-H1表達較 Jurkat和 JurkatE6-1升高（q＝9.476，12.154，P均＜0.05），而 B7-H3和 B7-H4表達在3種細胞中無明顯差別（F＝3.199，3.653，P均 ＞0.05）。

3 討論

B7家族共刺激分子在包括血液病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達，通過介導共刺激或共抑制信號，參與抗腫瘤免疫［2］。HLA抗原在多數(shù)腫瘤細胞中低表達或不表達，致腫瘤抗原提呈能力缺陷，影響T細胞活化，參與免疫逃逸［3-4］。不同亞細胞定位的負性B7分子B7-H1、B7-H3和B7-H4與多種腫瘤惡性程度及患者預后相關，可通過非免疫調(diào)控作用直接參與腫瘤形成［5-7］，是新的治療靶點。

本實驗結果顯示，B7.1膜蛋白主要表達于B細胞淋巴瘤、骨髓瘤細胞中；B7.2膜蛋白除在T淋巴母細胞白血?。馨土黾毎胁槐磉_外，其余細胞均表達或高表達。這與課題組既往研究結果一致［8］，提示多數(shù)人類惡性血液病細胞中，B7.1表達缺失或下調(diào)可能參與T細胞抗腫瘤免疫耐受。與多種實體腫瘤不同，接受標準化學免疫治療的彌漫大B細胞淋巴瘤患者中，HLA-Ⅰ類分子缺乏不是獨立預后因素，HLA-Ⅱ類分子缺乏才與無進展生存較短相關［9］。本實驗發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅰ類分子膜蛋白僅在K562中不表達，其余細胞均高表達；HLA-Ⅱ類分子膜蛋白除在K562及T淋巴母細胞白血病／淋巴瘤細胞中不表達外，其余細胞亦均表達或高表達。這可能與所選細胞株種類有關，另外也提示作為T細胞活化第一信號的重要組分HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子在多數(shù)人類惡性血液病細胞中表達基本正常，可能不是相應血液腫瘤發(fā)生的主要原因。近期一項研究發(fā)現(xiàn)，HLA-Ⅱ類分子膜蛋白表達陽性的B細胞淋巴瘤中，HLA-DM的丟失會引起胞膜不變鏈肽段異常表達，進而阻止抗原肽的有效呈遞［10］，此已成為一種新的腫瘤免疫逃逸機制。因此，T細胞活化第一信號的不同組分在血液腫瘤中的表達及意義需作更深入的研究。

既往研究結果顯示，B7-H1膜蛋白廣泛表達于間變大細胞淋巴瘤細胞株中，而極少表達于B細胞淋巴瘤細胞株中［11］；B7-H3膜蛋白在 27% （30／111）的急性髓細胞白血病患者腫瘤細胞中表達，其中以M5和M3型最顯著［12］；B7-H4膜蛋白在5株非霍奇金淋巴瘤細胞株中表達極少或不表達［13］。本實驗結果顯示，B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白在惡性血液病細胞中普遍低表達或不表達，僅CD279在 YTS、Maver、Z138和 CZ1中表達豐度較高，B7-H3在U937、Maver和Z138中表達豐度較高；與上述研究基本一致，提示上述B7分子在不同類型血液腫瘤中的作用可能不同，而具體何種分子可作為分子靶標仍需進行后續(xù)研究。

為進一步了解3種負性分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在惡性血液病細胞中的具體亞細胞定位，本實驗分別加用兩種破膜劑，結果顯示，3種分子的胞質(zhì)蛋白基本不表達，而胞核及胞質(zhì)蛋白則在除CZ1外的細胞株中異常表達或高表達，因此這3種分子主要定位于惡性血液病細胞核，與課題組既往研究結果一致［14］，進一步提示3種分子的胞核異常分布可能是參與血液腫瘤進展的重要因素；后續(xù)擬加用共聚焦顯微成像術、免疫組化等多種檢測方法深入研究。3種分子亞細胞定位不同，其臨床意義也不同：接受治療的轉移性結直腸癌和前列腺癌患者的循環(huán)腫瘤細胞中，B7-H1表達于胞膜和（或）胞質(zhì)及胞核，僅胞核表達與患者預后較差相關［5］。部分結直腸癌患者中，B7-H3表達于腫瘤細胞核，且豐度與患者預后負相關［15］；而另一部分患者中，B7-H3主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)或胞膜及基質(zhì)中，胞核表達與患者預后無關而與TNMⅠ期患者無復發(fā)生存率降低相關［6］。與早期肺腺癌患者相比，B7-H4在轉移性胸膜腺癌患者的核膜中表達較高、胞質(zhì)中表達較低，核膜蛋白水平與Ki-67正相關，提示患者預后較差［7］。針對惡性血液病中3種分子的表達分布如何，特別是胞核表達是否參與腫瘤形成并與患者預后相關，還需后續(xù)進行研究。

不同類型的惡性血液病細胞中，B7分子和HLA抗原的膜蛋白表達存在明顯差異：急慢性髓系白血病細胞株存在 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子不表達或不同程度的低表達，B7-H1及CD279不表達，卻不同程度表達B7-H4和B7-H3。B細胞淋巴瘤細胞株中，B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子均表達或高表達，B7-H1和 B7-H4基本不表達，CD279和B7-H3在套細胞淋巴瘤細胞中高表達、而在Burkitt淋巴瘤細胞中不表達。T淋巴母細胞白血病／淋巴瘤細胞株僅高表達HLA-Ⅰ類分子，不表達其余分子。這提示不同類型血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能受不同B7和HLA相關分子影響，具體各分子參與的權重有待進一步研究。即使同一腫瘤來源的細胞株，B7分子表達也存在差別，B細胞淋巴瘤細胞差異最顯著：Burkitt淋巴瘤來源的Raji和CA46相比，胞膜B7.1、胞膜 B7.2、胞核及胞質(zhì) B7-H4在 Raji中較高，胞核及胞質(zhì)B7-H1在CA46中較高。套細胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，胞膜B7.1在Maver中較高，胞膜B7.2、胞核及胞質(zhì)B7-H1在Z138中較高。同種類型惡性血液病中，B7分子的不同表達水平是否影響腫瘤進展及患者預后，有待進一步研究。

綜上，本實驗提示參與免疫逃逸的主要因素可能是B7.1分子表達缺失或低下，而不是HLA抗原缺乏；負性B7分子的異常表達及分布可能影響血液腫瘤進展；不同類型及同一腫瘤來源細胞中B7分子表達均存在差異，可能涉及腫瘤發(fā)生的相關機制。