尤宏釗 李玉琳 喬博康 王綠婭 陳博雅 智 瑩 杜 杰

隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療技術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)在急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)中的廣泛應(yīng)用，缺血再灌注損傷(ischemia /reperfusion, I/R)已經(jīng)成為了患者血運(yùn)重建過程后最常見的不良事件[1]。目前認(rèn)為在急性心肌梗死患者血運(yùn)重建后早期(3d內(nèi))是心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的重要時間節(jié)點(diǎn)[2]。在此期間，炎癥反應(yīng)和微循環(huán)障礙將會造成心肌細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡[3]。近些年，研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白作為蛋白質(zhì)的重要組成部分，與心臟缺血再灌注損傷早期的病理變化密切相關(guān)[4]。因此，探究早期膜蛋白譜的變化對于研究病理機(jī)制和篩選潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。但目前對于損傷早期心臟組織膜蛋白變化仍缺乏相關(guān)研究[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究某一類型組織中所有蛋白質(zhì)組成及其功能。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究常采用雙向凝膠電泳圖譜分析(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE)[6]，但是可鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量少且不能精確的定量分析。新近報道的同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)，不僅可以鑒定更多的蛋白質(zhì)種類，還可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量的定量分析并已應(yīng)用于心血管研究[7]。本項研究采用iTRAQ技術(shù)對I/R早期心臟組織膜蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)合生物信息學(xué),對I/R早期差異表達(dá)的膜蛋白所涉及的生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行了分析并探討了所涉及的信號通路。

材料與方法

1.動物選擇及分組 健康雄性，C57小鼠，15只，體質(zhì)量18～20g，由北京安貞醫(yī)院動物實(shí)驗中心提供。所有小鼠術(shù)前均禁食6h。本實(shí)驗利用隨機(jī)數(shù)字表法將15只小鼠分為三組(n=5)：分別為對照組(Sham組)，缺血再灌注1d組(I/R 1d組)，缺血再灌注1d組(I/R 3d組)。

2.材料及試劑 Q-Exactive質(zhì)譜儀和Easy nLC1000納升級液相色譜儀購自Thermo Finnigan(美國)。膜蛋白純化試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自ThermoFisher(美國)。胰蛋白酶、SiTRAQ-plex標(biāo)記試劑盒及緩沖液購自Applied Biosystems(美國)。

3． 心肌缺血再灌注損傷模型的制備 動物模型具體過程如本研究室前文所述[8]。造成心肌缺血后30 min后松開結(jié)扎線，分別恢復(fù)血流24h和72h。心肌缺血再灌注損傷在體動物模型的制作以心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬和心肌顏色由正常顏色變蒼白再變成暗色表示結(jié)扎成功實(shí)驗過程中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。死亡動物隨時補(bǔ)充。

4．小鼠心臟組織的制備及膜蛋白純化 各組取3只小鼠，Sham組取稱重時刻，I/R組于I/R后1d和3d取小鼠左心室結(jié)扎線以下組織，用液氮迅速冰凍并放入-80℃冰箱保存。膜蛋白純化按照ThermoFisher試劑盒說明書進(jìn)行，并按照前人研究所述進(jìn)行驗證[9]。

5．酶解及肽段定量標(biāo)記 各取200μg樣品，分別加入DTT至終濃度為100mM，沸水浴5min，冷卻至室溫。加入200μL UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)混勻，轉(zhuǎn)入10kd超濾離心管，之后進(jìn)行梯度離心。各組樣品肽段分別取約100μg,按照AB公司試劑盒:iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記。

6．質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)用軟件Proteome Discoverer1.4進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 1.4(version1.4.0.288, Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫為uniprot mouse complete proteome database (Release 2013_06)合并常見污染庫。采用Sequest HT檢索， 檢索的肽段和譜圖匹配(PSM)采用Percolator算法進(jìn)行過濾，q值<1%(1%的FDR)。檢索后的肽段利用嚴(yán)格的最大簡約原則合并成蛋白。

7．生物信息學(xué)分析 為了減少物種之間蛋白質(zhì)的異質(zhì)性，所有差異蛋白均首先利用Uniprot比對了人和小鼠中表達(dá)量的差異(www.uniprot.org)，并經(jīng)過TMHMM 2.0對差異蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。使用AgriGO進(jìn)行g(shù)ene ontology(GO)注釋和富集分析。 GO項目描述了蛋白質(zhì)在三個領(lǐng)域中的作用：生物過程，細(xì)胞成分和分子功能。 在注釋和注解增加之后，在“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”(KEGG，http：//www.genome.p/kegg/)中依次將酶映射到注釋序列和代謝途徑[10]。

8．統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。體重等正態(tài)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 兩組間比較采用t檢驗; 蛋白質(zhì)表達(dá)量等偏態(tài)計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

結(jié) 果

1. 缺血再灌注損傷造模及膜蛋白純化的結(jié)果 結(jié)扎小鼠前降支后，利用心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬表示造模成功。首先利用蛋白質(zhì)印跡分析檢測膜蛋白提取液的純度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜標(biāo)記(Na +/ K+ATP酶)在膜蛋白溶液的水平遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)蛋白的組織。相反，膜蛋白溶液中的細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記(GAPDH)均低于再灌注損傷和正常心臟組織的細(xì)胞質(zhì)蛋白(圖1)。 這些結(jié)果表明膜蛋白成功純化。

圖1 膜蛋白純化的鑒定

2. 蛋白質(zhì)的鑒定和定量結(jié)果 基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，本研究揭示了缺血再灌注損傷過程中早期差異表達(dá)的膜蛋白。利用質(zhì)譜技術(shù)，一共鑒定了23 872種獨(dú)特的肽，對應(yīng)于2 224種蛋白質(zhì)。其中，預(yù)測跨膜域后共鑒定到901個具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白。比較不同時間點(diǎn)的膜蛋白定量結(jié)果，在I/R 1d后/Sham組共鑒定到有895個膜蛋白。在I/R 后3d與/I/R后1d組中鑒定到897個膜蛋白。

3. 缺血再灌注損傷早期不同階段膜蛋白表達(dá)譜 為了進(jìn)一步篩選具有差異的膜蛋白，我們定義兩組之間差異倍數(shù)>1.5或者<0.67為差異蛋白，同時還應(yīng)滿足所選擇肽鏈>1、置信區(qū)間>95%[11]。在鑒定到的蛋白中，I-R 1d / Sham組共有211個蛋白上調(diào)，有217個蛋白下調(diào)；在I/R 3d / I/R 1天組中有205個是上調(diào)蛋白，222個是下調(diào)蛋白。進(jìn)一步取差異蛋白的交集，我們發(fā)現(xiàn)了兩種膜蛋白的表達(dá)譜：154種蛋白在I/R早期1d和3d均持續(xù)升高；200種蛋白在I/R早期1d和3d均持續(xù)降低，但沒有蛋白在I-R 1d和3d呈現(xiàn)相反的趨勢(圖2)。

4. 差異蛋白的生物信息學(xué)分析和涉及的信號通路 為了更好地研究差異蛋白地總體趨勢和功能學(xué)分類，我們采用Gene Ontology(GO)對不同階段差異表達(dá)的全部501個蛋白進(jìn)行了富集分析。差異蛋白的GO分析被分為了生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)三部分組成，主要結(jié)果呈現(xiàn)在圖3。

圖2 缺血再灌注損傷差異蛋白的分布

在生物過程中，I/R后1d與Sham相比，差異表達(dá)的膜蛋白中主要涉及氧化應(yīng)激，能量代謝、電子傳遞鏈(圖3A)；I/R后3d與I/R后1d相比，差異表達(dá)的膜蛋白中主要涉及氧化還原、能量代謝途徑以及電子傳遞鏈(圖3B)。在細(xì)胞成分上，由于進(jìn)行了膜蛋白純化，差異表達(dá)的蛋白主要集中在膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外泌體和線粒體等具有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞成分(圖3C，D)。在分子功能上，I/R后1d與Sham相比，差異表達(dá)的膜蛋白中主要涉及離子結(jié)合，核苷酸結(jié)合和通道蛋白(圖3E)。I/R后3d與I/R后1d相比，差異表達(dá)的膜蛋白中差異表達(dá)的膜蛋白中主要涉及離子結(jié)合，骨架蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖3F)。離子結(jié)合包括了陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合等。

圖3 缺血再灌注損傷早期差異表達(dá)膜蛋白的生物信息學(xué)分析 A:I/R1天的生物進(jìn)程分析；B:I/R3天的生物進(jìn)程分析; C:I/R1天的細(xì)胞成分預(yù)測；D:I/R3天的細(xì)胞成分預(yù)測;E:I/R1天的分子功能預(yù)測；F:I/R3天的分子功能預(yù)測

5. 差異蛋白所涉及信號通路的探究 為了探究差異膜蛋白所涉及的信號通路，我們采用KEGG分析對差異蛋白進(jìn)行了鑒定。I/R后1d和3d的心臟組織膜蛋白主要涉及信號通路主要是氧化磷酸化、糖代謝、脂代謝心肌收縮。

圖4 缺血再灌注損傷早期差異表達(dá)膜蛋白的通路 A:I/R 1d的信號通路分析；B:I/R 3d的信號通路分析

討 論

缺血再灌注損傷是急性心肌梗死患者最常見的不良事件。了解心肌缺血再灌注過程中的蛋白質(zhì)合成與調(diào)控對研究疾病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)具有重要的意義。有關(guān)缺血再灌注損傷的研究多數(shù)集中于探究差異表達(dá)蛋白質(zhì)在疾病中起到的作用，很少有研究關(guān)注早期蛋白譜的變化。以前的研究表明，缺血再灌注損傷早期是損傷發(fā)生的關(guān)鍵階段。在這個階段，心肌細(xì)胞凋亡和微循環(huán)障礙作為缺血再灌損傷早期的重要病理特征同時發(fā)生[12-13]。其中，膜蛋白都起到了重要的作用[14]。為了更好的理解缺血再灌注損傷早期所涉及的膜蛋白變化，我們基于iTRAQ首次定量檢測了I/R早期差異表達(dá)的膜蛋白, 結(jié)合生物信息學(xué)和公共數(shù)據(jù)庫，描繪了差異膜蛋白譜，也發(fā)現(xiàn)其中主要涉及的病理過程是氧化應(yīng)激和能量代謝。

1.膜蛋白和氧化應(yīng)激 以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷早期的重要病理生理過程[15]。膜蛋白作為重要的信號受體，不僅可通過激活下游通路調(diào)節(jié)調(diào)控病理過程，此外部分細(xì)胞膜降解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的炎性趨化作用，使微循環(huán)中的白細(xì)胞大量增加，加重了微循環(huán)障礙。S1PR1作為信號分子受體，激活后可以減少心肌心肌細(xì)胞的氧自由基的形成，從而達(dá)到抗氧化的作用[16]。TLR3是TLR樣受體中重要的成員,主要分布在細(xì)胞的內(nèi)涵體上。其他TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同,TLR3識別配體后通過含有TRIF結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)接蛋白參與調(diào)控了I-R損傷后細(xì)胞的氧化應(yīng)激[17]。除了細(xì)胞表面的膜蛋白以外，線粒體的膜蛋白也被認(rèn)為與缺血再灌注損傷有關(guān)。例如Ca2+攝取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是線粒體的內(nèi)膜蛋白,可以調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),防止線粒體內(nèi)出現(xiàn)Ca2+超載發(fā)生。氧化應(yīng)激可引起MICU1變構(gòu)，使鈣離子內(nèi)流增加，造成鈣超載，從而可導(dǎo)致并促進(jìn)細(xì)胞的不可逆性損傷[18]。盡管目前減少氧化應(yīng)激帶來的心肌損傷已經(jīng)作為治療心臟缺血再灌注損傷的重要干預(yù)手段，但是新型藥物的臨床治療效果欠佳[19]，更有針對性的治療靶點(diǎn)有待發(fā)現(xiàn)。既往的蛋白芯片研究對于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)所提供的研究價值有限，而本項研究的結(jié)果為尋找新的分子靶標(biāo)提供了更為直接的組學(xué)依據(jù)。

2.膜蛋白和能量代謝 能量代謝是心臟缺血再灌注損傷的始動因素。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)能量代謝障礙發(fā)生后心肌細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)均受到影響，且心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平與心肌細(xì)胞的凋亡、壞死密切相關(guān)[20]。由于再灌注損傷期間，線粒體的結(jié)構(gòu)、功能因缺血遭到嚴(yán)重破壞，不能進(jìn)行有效的有氧氧化產(chǎn)能，導(dǎo)致恢復(fù)再灌注的相當(dāng)一段時間內(nèi)能量來源仍然主要依靠糖酵解。我們的實(shí)驗結(jié)果表明再灌注早期，與三羧酸循環(huán)相關(guān)的膜蛋白表達(dá)下調(diào)，但氧化磷酸化的膜蛋白表達(dá)量卻增強(qiáng)，這點(diǎn)與前人的研究相一致。GLUT4不僅參與糖代謝、脂肪酸代謝，在缺血再灌注損傷中也起到重要作用。脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存和利用都有賴于膜蛋白的參與[21-22]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞脂肪酸氧化向糖酵解轉(zhuǎn)變，而使得心肌內(nèi)脂質(zhì)的聚集和利用減少[23]，這也解釋了我們的結(jié)果中第1天和第3天脂代謝整體水平持續(xù)下降的原因。另外，氧自由基引起的過氧化反應(yīng)對膜磷脂造成了損傷，造成線粒體的電子傳遞鏈也受到了影響。前人研究認(rèn)為雖然再灌注損傷后電子傳遞鏈整體的表達(dá)水平是上升的，但是復(fù)合物I-III的結(jié)構(gòu)卻出現(xiàn)了損傷[24]。我們的結(jié)果從蛋白水平印證了前人的結(jié)果，但是電子傳遞鏈各復(fù)合體作用于缺血再灌注損傷的機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步的研究，特別是蛋白質(zhì)絕對定量的結(jié)果。

我們的研究首次利用相對定量的方法，探究了與正常心臟相比，I/R 1d后和3d膜蛋白的差異，并結(jié)合生物信息學(xué)，對差異膜蛋白進(jìn)行了GO分析和通路分析，為探究膜蛋白在缺血再灌注損傷早期的作用及尋找潛在的治療靶點(diǎn)提供了可靠的組學(xué)結(jié)果。盡管如此，本項研究仍存在兩點(diǎn)局限，一是iTRAQ實(shí)驗過程中大量共洗脫肽段對定量準(zhǔn)確性有一定影響，同時由于缺少內(nèi)標(biāo)，差異蛋白的鑒定是相對定量的結(jié)果，對于每一種差異蛋白仍需要進(jìn)一步絕對定量的結(jié)果。二是盡管我們對于每一個差異蛋白也用公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對人和鼠之間的差異，但仍不能完全消除可能受不同物種間異質(zhì)性的影響。

綜上所述，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可有效地用于組織蛋白鑒定和相對定量，利于更好地了解膜蛋白與心臟缺血再灌注損傷早期病理變化的關(guān)系。本項研究的結(jié)果為探究缺血再灌注損傷早期心臟組織膜蛋白所涉及的病理過程和潛在的治療靶點(diǎn)提供了新的觀點(diǎn)和證據(jù)。