李延珍 李忠輝 李 良 楊 建 李 銳 李國慶 董志歡 郭海平

（河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002）

心律失常（arrhythmia）是心肌缺血再灌注后常見并發(fā)癥，室性心動(dòng)過速（VT）和心室顫動(dòng)（室顫，VF）是其主要表現(xiàn)形式，嚴(yán)重者甚至危及生命［1］，有效防治心律失常已經(jīng)成為減輕心肌缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）主要成分為銀杏內(nèi)酯，其中銀杏內(nèi)酯A占35%、銀杏內(nèi)酯B占60%、銀杏內(nèi)酯C占2%、銀杏內(nèi)酯K占2%，既往研究發(fā)現(xiàn)DGMI具有抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)作用［2-4］，并且張志雄等研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對心律失常具有一定的治療作用［5］，其中銀杏酮酯能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷而對心肌缺血再灌注所致心律失常具有一定的抑制作用［6］，但DGMI對心肌缺血再灌注所致心律失常是否具有抑制作用的研究報(bào)道尚不多見。本研究通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，以維拉帕米為陽性對照藥物，探討DGMI對心肌缺血再灌注性心律失常的作用及其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，220～260 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。 飼養(yǎng)環(huán)境 23～25 ℃、相對濕度55%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 （規(guī)格：25 mg∶5 mL，批號(hào)：20170416）；維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司（批號(hào)：43170116）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：170113、161217、161029、160815、161010）；鈣標(biāo)準(zhǔn)液（上海生物制品研究所）。

1.3 主要儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)（X-300型，成都泰盟儀器廠）；三道心電圖機(jī)（XD-30C型，上海醫(yī)用電子儀器廠）；紫外-可見分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；原子吸收光度計(jì)（WFD-Y2型，北京第二光學(xué)儀器廠）。

1.4 分組與給藥 將120只實(shí)驗(yàn)用大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，DGMI低（1.5 mg/kg）、中（3 mg/kg）、高（6 mg/kg）劑量組和維拉帕米組［2.5 mg/（kg·d）］各 20 只。DGMI各劑量組和維拉帕米組分別連續(xù)腹腔注射給藥7 d，每日1次，假手術(shù)組和模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液。

1.5 模型制備 末次給藥2 h后，參照睢大員等［7］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，結(jié)扎30 min后恢復(fù)再灌注，假手術(shù)組行手術(shù)通路但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖實(shí)施監(jiān)測。造模成功的判斷［8］：心電圖示ST段抬高、心肌局部變蒼白示結(jié)扎成功；蒼白心肌恢復(fù)紅潤、ST段抬高恢復(fù)1/2以上示再灌注成功。再灌注60 min后行各指標(biāo)檢測。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）心電指標(biāo)監(jiān)測。全程實(shí)施Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測，再灌注60 min后記錄各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化；觀察并計(jì)算室性心動(dòng)過速（VT）、室顫（VF）的發(fā)生率；心律失常評(píng)分方法［9］：未發(fā)生或＜5次室性前期收縮，計(jì) 0分；僅≥5次室性前期收縮，計(jì)1分；僅＜60 s室性心動(dòng)過速，計(jì)2分；一陣≥60 s或多陣?yán)塾?jì)＜60 s室性心動(dòng)過速，計(jì)3分；多陣VT累計(jì)＞60 s，計(jì)4分；出現(xiàn)VF計(jì)5分。2）心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度檢測。麻醉后，開胸取心臟組織，于4℃環(huán)境剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測心肌組織中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性；心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以Ca2+標(biāo)準(zhǔn)液為標(biāo)準(zhǔn)對照，通過原子吸收光度計(jì)測定。3）心肌組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性及MDA含量檢測。取制備好的心肌組織勻漿液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段比較見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PR間期、QRS間期顯著縮短而ST段明顯抬高（P<0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組PR間期、QRS間期顯著延長且ST段抬高程度顯著降低 （P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段比較（x±s）

2.2 各組大鼠心律失常發(fā)生率比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VT、VF發(fā)生率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組大鼠VT、VF發(fā)生率顯著降低（P<0.01）。

表2 各組大鼠VT、VF發(fā)生率比較［n（%）］

2.3 各組大鼠心律失常評(píng)分比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心律失常評(píng)分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組大鼠心律失常評(píng)分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠心律失常比較（分，x±s）

2.4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度比較 見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低而Ca2+濃度顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均顯著升高且Ca2+濃度顯著降低（P<0.05 或 P<0.01）。

表4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及 Ca2+濃度比較（x±s）

2.5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較 見表5。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組

冠狀動(dòng)脈再通、恢復(fù)血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者預(yù)后，尤其再灌注性心律失常是導(dǎo)致心肌梗死患者早期死亡的主要原因［10-12］，因此開發(fā)抗缺血再灌注性心律失常藥物具有重要意義。

維拉帕米為臨床治療心律失常常用藥物，能夠通過阻滯鈣離子通道而達(dá)到抑制心肌缺血性心律失常的作用［13］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇維拉帕米作為陽性對照藥物。銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、K等，既往研究發(fā)現(xiàn)DGMI具有多種生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，術(shù)前7 d（每日1次）腹腔注射給予DGMI進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)DGMI預(yù)處理能夠有效延長心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期、QRS間期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF發(fā)生率，降低心律失常評(píng)分，提示DGMI對心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞生存與做功均依賴有氧代謝ATP，因此線粒體中ATPase活性對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞內(nèi) Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子穩(wěn)定具有重要作用［8］。 心肌缺血缺氧將導(dǎo)致能量代謝障礙，進(jìn)而引發(fā)依賴ATP的Ca2+-Mg2+-ATPase活力降低；而Ca2+-Mg2+-ATPase是將Ca2+泵出細(xì)胞外的主要途徑，其活力下降將致胞內(nèi)Ca2+超載而引發(fā)心律失常［9，14］。 氧自由基損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一［15-18］，而氧自由基的損傷及能量耗竭，使Na+-K+-ATPase活力進(jìn)一步降低，使細(xì)胞外K+增多，且呈現(xiàn)自缺血中央?yún)^(qū)至邊緣區(qū)K+含量逐漸下降的不均勻分布態(tài)勢［19］，而局部K+分布不均勻可促進(jìn)心律失常的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SOD、GSH-Px活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），維拉帕米組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（x±s）

3 討 論

DGMI預(yù)處理能夠改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活力并降低Ca2+含量，改善抗氧化酶（SOD、GSHPx）活性并降低MDA含量，這可能是DGMI抑制心肌缺血再灌注性心律失常的重要分子機(jī)制之一。

綜上所述，DGMI對大鼠心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與DGMI改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase 活力并降低 Ca2+含量以及抑制氧自由基損傷有關(guān)。本研究為DGMI用于心梗溶栓所致心律失常的治療提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支持，也為該并發(fā)癥的防治提供了新的參考方案。