李益萍 張言玉 許笑雯 王肖龍

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 201203）

目前，我國心血管患者約有 2．9 億［1］。 脂代謝紊亂在心血管病的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，有效控制血脂可降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。他汀類藥物已成為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病治療基石。但在臨床實(shí)踐中，許多患者單用他汀類藥物治療其血脂水平仍不能達(dá)標(biāo)。2012年血脂異常國際研究——中國住院患者他汀類藥物治療率88．9%，接受治療患者中，38．5%未達(dá)低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）目標(biāo)值［1］。 他汀作用靶點(diǎn)單一，主要是抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，他汀劑量加倍僅能使LDL-C再降低6%左右，而肝臟損害及橫紋肌溶解等不良反應(yīng)的發(fā)生率增加。血脂的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種途徑、多種基因的調(diào)控，不同的降血脂途徑間又有一定的關(guān)聯(lián)性，不能靠單一的途徑或靶點(diǎn)來解決。因此，在他汀類藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合其他降膽固醇機(jī)制的藥物可能具有協(xié)同降低 LDL-C的優(yōu)勢，成為近年臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。鑒于目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中其他降膽固醇機(jī)制的藥物因其價(jià)格昂貴或缺乏臨床硬終點(diǎn)的證據(jù)，短期內(nèi)無法大量廣泛應(yīng)用于臨床?；A(chǔ)和臨床研究表明中藥可以影響膽固醇吸收、體內(nèi)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄等代謝途徑，改善臨床心血管事件終點(diǎn)［4］。因此觀察中醫(yī)藥對膽固醇其他代謝途徑的作用并深入探討其機(jī)制，能夠?yàn)榘l(fā)展中醫(yī)藥和臨床干預(yù)提供確切的依據(jù)?；钛捣绞潜狙芯拷M在“痰瘀同治”的治法下，沿用并繼承經(jīng)典原方《太平惠民和劑局方》二陳湯、四物湯合《濟(jì)生方》二至丸自擬的降脂方，主要由丹參、當(dāng)歸、陳皮、決明子、山楂、黃連等組成。研究發(fā)現(xiàn)活血化痰方中黃連、決明子、山楂等組成成分可通過調(diào)控膽固醇的代謝途徑中的重要酶活性、蛋白或基因的表達(dá)來降脂［4］。因此，本研究旨在觀察活血化痰方的降脂效果及探索其降脂的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取36只SPF級別SD雄性大鼠，180～200 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（動(dòng)物許可證號：SCXK2017-0005），所有大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境干燥、通風(fēng)，溫度20～26℃，濕度40%～70%。高脂飼料配方：78.8%繁殖鼠料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽。由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：蘇飼證（2014）01008。

1.2 試劑與儀器 活血化痰方水煎液：委托上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑科采購中藥并制備水煎液?？啥ǎ郯⑺估邓帢I(yè)（中國）有限公司，批號：132756］。試劑：總膽固醇（TC）測定試劑盒、三酰甘油（TAG）測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒、血清前蛋白枯草酶溶菌素9（PCSK9）酶聯(lián)免疫試劑盒、血漿卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）酶聯(lián)免疫試劑盒、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP）酶聯(lián)免疫試劑盒和肝脂酶（HL）酶聯(lián)免疫試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。儀器：Beckman coulter離心機(jī) （美國貝克曼）；高速冷凍離心機(jī)（Neofuge13R，Heal Force）；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標(biāo)儀 （芬蘭制造）；Mettler-Toledc電子天平 （上海梅特勒-托儀多公司）；動(dòng)物手術(shù)器械（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；10%甲醛（上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號：RS-40371）；石蠟切片機(jī)（上海榕柏生物技術(shù)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（上海思長約光學(xué)儀器有限公司）；渦旋振蕩器 votex-2（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；15 mL硅化離心管（corning）；10 mL無菌注射器 （上?？等R德企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 SD大鼠36只據(jù)體質(zhì)量和隨機(jī)數(shù)字表完全隨機(jī)區(qū)組分組，共分為6組（n=6）：空白組、模型組、可定組、活血化痰方低劑量組、活血化痰方等效劑量組、活血化痰方+可定組?？瞻捉M予基礎(chǔ)飼料，其余各組均予高脂飼料（10 g飼料/100 g）。造模的同時(shí)各藥物組按人-動(dòng)物藥物劑量換算表分別給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃劑量：可定組（0.76 mg/kg）、活血化痰方低劑量組（3.5 g/kg）、活血化痰方等效劑量組（14 g/kg）、活血化痰方+可定組（活血化痰方14 g/kg，可定0.76 mg/kg），空白組和模型組分別給予等量蒸餾水灌胃。各組動(dòng)物均自由飲水?dāng)z食，每周稱體質(zhì)量1次，以調(diào)整飼料喂養(yǎng)量及藥物灌胃量。實(shí)驗(yàn)周期為8周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 喂養(yǎng)8周后，各組動(dòng)物禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量后行3%戊巴比妥稱定質(zhì)量麻醉，剪開皮膚肌肉，找到腹主動(dòng)脈，3.8%枸櫞酸鈉潤洗的10 mL注射器，以腹主動(dòng)分叉處向心端1～3 mm處穿刺取血，取血后3000 r/min，離心10 min后分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。處死?dòng)物后迅速分離肝臟，在4℃0.9%氯化鈉注射液中漂清血水，使用濾紙吸干后浸泡于10%福爾馬林備用。采用生化法檢測大鼠血清 TAG、TC、HDL-C、LDL-C 的水平；采用 ELISA 法測定PCSK9、LCAT、CETP、HL的水平，以上指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。肝臟病理：將浸泡于10%甲醛中的肝臟經(jīng)石蠟包埋切片，常規(guī)取材和固定、脫水和包埋、切片及染色等操作后，置于光學(xué)顯微鏡下，以觀察各組大鼠肝臟。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPASS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］表示。 符合正態(tài)性及方差齊性組間比較使用單因素方差分析，不符合正態(tài)性和 （或）方差齊性組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 見表1。各組間治療前大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；8周后，各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，x±s）

2.2 各組大鼠血脂水平比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清的 TC、TAG、LDL-C 顯著上升（P<0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清的TAG、LDL-C均下降（P<0.05）；與模型組比較，可定組與活血化痰方+可定組的TC顯著下降（P<0.05）。

表2 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

2.3 各組大鼠血脂代謝途徑的影響比較 見表3。與模型組相比，活血化痰方低劑量組、活血化痰方等效劑量組、活血化痰方＋可定組的PCSK9均下降（P<0.05），活血化痰方等效劑量組的HL有升高的趨勢。

2.4 各組大鼠肝臟組織病理結(jié)果 見圖1。肉眼觀察空白組大鼠肝臟外形正常，包膜光滑，顏色暗紅；模型組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色淡黃，包膜緊張，質(zhì)地較軟，切面有油膩感。光鏡下觀察，空白組大鼠肝小葉和肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多大小不等的脂肪滴，部分肝細(xì)胞核被脂肪滴擠壓而明顯偏位，脂質(zhì)沉積明顯，肝臟脂肪變性程度較為嚴(yán)重；與模型組比較，各藥物組肝小葉和肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)較為清晰，且肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性程度明顯減輕；可定組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹現(xiàn)象。

表3 各組大鼠血脂代謝途徑比較（ng/mL，x±s）

圖1 各組肝臟組織結(jié)構(gòu)（HE染色，20倍）

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在他汀類藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用不同作用機(jī)制的降脂藥物主要有依折麥布［5］、PCSK9抑制劑、微粒體TAG轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑等，但因其價(jià)格昂貴［6］或缺乏臨床硬終點(diǎn)的證據(jù)［7-8］，短期內(nèi)無法大量廣泛應(yīng)用于臨床。中醫(yī)藥也進(jìn)行了許多的基礎(chǔ)與臨床干預(yù)研究，如中國冠心病二級預(yù)防研究發(fā)現(xiàn)采用血脂康常規(guī)劑量適度調(diào)脂，就可使中國冠心病患者獲益［9］。高脂血癥的形成與肝脾腎的功能失調(diào)密切相關(guān)，肝脾腎功能失調(diào)為本、痰瘀阻滯為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)相互作用形成惡性循環(huán)，日久脈絡(luò)受損，引發(fā)心腦血管病。臨床上高脂血癥患者往往痰濁與血瘀并見［10-11］，故本研究組在“痰瘀同治”的治則下，自擬了“活血化痰方”。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明活血化痰方低劑量與等效劑量組均可有效降低高脂血癥SD大鼠血清TAG和LDL-C的水平，其療效與可定一致，活血化痰方與可定聯(lián)合應(yīng)用有進(jìn)一步降低LDL-C水平的趨勢。PCSK9是參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程的一種重要蛋白酶，可在蛋白水平降低肝細(xì)胞表面LDLR的數(shù)量，從而降低肝細(xì)胞對血液中LDL-C的清除能力，因此抑制PCSK9的活性及表達(dá)可降低體內(nèi)LDL-C的水平。當(dāng)血液中LDLC水平增加時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)LDL-C水平降低，肝細(xì)胞表面LDLR的數(shù)量減少，從而血清PCSK9的水平會(huì)反饋性減少，這與本研究結(jié)果一致。他汀在降脂的同時(shí)可引起的PCSK9分泌增加，此種效應(yīng)會(huì)降低（至少部分）他汀的療效［12-14］。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與單純可定組相比，活血化痰方＋可定組具有進(jìn)一步降低LDL-C、PCSK9水平的趨勢，這提示活血化痰方可抑制他汀類藥物引起的PCSK9反饋性增加，具有潛在增加他汀類藥物降脂療效的作用。

HL是參與脂蛋白代謝過程的關(guān)鍵酶之一，HL活性增強(qiáng)可降低TAG水平［15］。本研究發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，可定組的HL水平明顯降低，中藥等效劑量組的HL有升高趨勢，而基礎(chǔ)研究顯示活血化痰方可降低TAG，說明活血化痰方降低TAG的機(jī)制可能與升高血清HL水平有關(guān)。LCAT、CETP為參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程的2種重要蛋白，兩者活性及表達(dá)的增強(qiáng)可促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血液和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇［16］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活血化痰方未顯示出對LCAT、CETP水平有影響，這與HDL-C的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果一致。

肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要場所，各種原因引起脂質(zhì)代謝紊亂均可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肝臟病理結(jié)果表明活血化痰方可能通過抑制肝臟合成和（或）促進(jìn)肝臟排泄等途徑影響脂質(zhì)在肝細(xì)胞的沉積，是否與調(diào)控膽固醇細(xì)胞內(nèi)合成相關(guān)的HMGCoA還原酶，與膽固醇肝臟排泄相關(guān)的膽固醇-7α 羥化酶（CYP7A1）［17］等的表達(dá)有關(guān)，尚需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究認(rèn)為活血化痰方能有效降低高脂血癥大鼠血清LDL-C、TAG水平，與可定的降脂療效相當(dāng)，其機(jī)制可能分別與其調(diào)節(jié)血清PCSK9水平、升高血清HL水平有關(guān)，同時(shí)活血化痰方能夠顯著改善高脂血癥大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。但活血化痰方調(diào)節(jié)血脂的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究，以明確其更有效的作用靶點(diǎn)。