董 靖，李紅麗，董 智，白文華

(山東省土壤侵蝕與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰山森林生態(tài)站，山東 泰安 271018)

鹽脅迫是影響植物生存、生長和生產(chǎn)力的主要環(huán)境因素之一[1-2]。鹽堿土中的氯化物、硫酸鹽及含鹽量導(dǎo)致的鹽脅迫不僅直接影響植物種子的萌發(fā)、植物的生長和產(chǎn)量[3]，而且影響植物的抗氧化系統(tǒng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響光合作用等代謝活動(dòng)，使植物的正常生命活動(dòng)受到影響[4-6]，不同的植物可以通過內(nèi)部調(diào)節(jié)或外源物質(zhì)調(diào)節(jié)而減緩鹽脅迫對植物體內(nèi)生理生化、氧化損傷、膜透性、葉綠素等的傷害[7-10]。因此，深入了解植物對鹽脅迫的各種信號響應(yīng)機(jī)制以及抵御鹽脅迫的各種途徑具有十分重要的價(jià)值[11]。

H2S是生物體內(nèi)繼NO和CO后的第3種氣體信號分子[12]，在生物生長發(fā)育及非生物應(yīng)答脅迫等方面具有重要作用，已成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[13]。已有的研究表明，H2S可以促進(jìn)種子萌發(fā)，根的發(fā)生，調(diào)節(jié)光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)，并參與抵抗重金屬、鹽、干旱、高溫等脅迫[14-17]。

草木樨(Melilotussuaveolens)為豆科草木樨屬一、二年生草本植物，其根系發(fā)達(dá)，固土與改良土壤能力強(qiáng)，防風(fēng)固沙效果好，營養(yǎng)豐富，適口性好，是優(yōu)良的保持水土、防風(fēng)固沙和改良土壤用牧草，也是山東省當(dāng)家牧草之一。草木樨抗鹽能力較強(qiáng)，也是改良土壤鹽堿化的理想牧草[18]。盡管草木樨的耐鹽能力較一般植物強(qiáng)，但鹽脅迫依然會(huì)使其產(chǎn)量顯著下降，研究草木樨的抗鹽特性及機(jī)制可以提高其在鹽堿地改良中的應(yīng)用價(jià)值。盡管汪永平等[19]比較研究了不同品種草木樨的抗鹽性，然而在外源物質(zhì)對草木樨抗鹽性的研究方面尚未見報(bào)道，外源物質(zhì)對其生理生化作用的機(jī)制尚不清晰。為闡明外源H2S在草木樨抗鹽性中的作用，本研究通過外源H2S處理NaCl脅迫下的草木樨幼苗，對草木樨幼苗生長過程中的生理生化指標(biāo)及抗氧化酶活性變化進(jìn)行研究，旨在探索外源H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗生長的緩解效應(yīng)，并篩選出緩解NaCl鹽脅迫的適宜H2S濃度，為提高草木樨耐鹽性及揭示其耐鹽機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017年4-7月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗(yàn)站的全日光溫室內(nèi)(36°16′ N，117°11′ E)進(jìn)行，試驗(yàn)期間日照時(shí)間平均為10 h，日均溫在20～25 ℃，相對濕度65%，CO2濃度基本與大氣濃度持平。

1.2 材料與處理

試驗(yàn)所用草種采自內(nèi)蒙古草木樨栽培草地，發(fā)芽率95%以上。挑選種粒飽滿、大小均勻的草木樨種子，用3%的H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗3～4次，浸種催芽后播種于裝有蛭石的花盆中?；ㄅ韪?5 cm、上口徑35 cm，下口徑30 cm，花盆底部開孔，并用無紡布遮蓋，保證盆內(nèi)基質(zhì)不外流，且可通過底部開孔吸水。種子萌發(fā)后澆灌1/2 Hoagland完全營養(yǎng)液，生長40 d后選擇長勢良好的植株進(jìn)行水培處理。取幼苗用海綿條包裹好，固定在泡沫板的孔內(nèi)，每個(gè)孔固定幼苗4株，然后將固定有幼苗的泡沫板轉(zhuǎn)移到裝有完全營養(yǎng)液的塑料盆(高13 cm，寬28 cm，長35 cm)中進(jìn)行培養(yǎng)(為了避免光照使?fàn)I養(yǎng)液的溫度升高和營養(yǎng)液表面生長綠藻，試驗(yàn)用鋁箔紙將塑料盆緊密包裹)，每個(gè)塑料盆內(nèi)裝有4.4 L營養(yǎng)液。共分為8個(gè)處理(表1)，分別為：對照[CKn和CKp(150 mmol·L-1NaCl的確定是在預(yù)試驗(yàn)中完成的，該NaCl濃度處理幼苗15 d后多個(gè)指標(biāo)均為空白對照的50%左右，且其他指標(biāo)與對照差異極顯著，故選用此濃度)]；Ⅰ，150 mmol·L-1NaCl+0.025 mmol·L-1NaHS；Ⅱ，150 mmol·L-1NaCl+0.05 mmol·L-1NaHS；Ⅲ，150 mmol·L-1NaCl+0.1 mmol·L-1NaHS；Ⅳ，150 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1NaHS；Ⅴ，150 mmol·L-1NaCl+0.4 mmol·L-1NaHS；Ⅵ，150 mmol·L-1NaCl+0.8 mmol·L-1NaHS。試驗(yàn)中先將NaHS按處理濃度配制成溶液后直接噴施在草木樨葉面，以葉片布滿液滴為準(zhǔn)，每天噴施1次，獲得不同的H2S處理，NaCl直接配制在營養(yǎng)液中，每個(gè)處理3次重復(fù)。處理15 d后取樣測定各個(gè)指標(biāo)。為保證NaCl濃度穩(wěn)定，每2 d換1次營養(yǎng)液，并且每天向營養(yǎng)液中通入空氣，以保證氧氣的供應(yīng)充足。

表1 試驗(yàn)處理編號Table 1 Experimental design

1.3 測定指標(biāo)及方法

葉片相對含水量采用蒸餾水浸泡及烘干稱重法測定；細(xì)胞膜相對透性用電導(dǎo)法測定；采用水合茚三酮法測定游離脯氨酸含量；采用蒽酮法測定可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量[20]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量；酶液的提取參考de Azevedo等[21]的方法，SOD活性采用鄰苯三酚自氧化速率法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定；葉綠素含量采用丙酮乙醇混合液提取，然后用分光光度計(jì)測定[20]。

所有數(shù)據(jù)均用3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，SPSS(16.0)軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法多重比較，差異顯著定義為P<0.05，利用隸屬函數(shù)法[22]對各指標(biāo)進(jìn)行綜合比較，Excel 2010制作相應(yīng)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗葉片相對含水量及相對電導(dǎo)率的影響

150 mmol·L-1鹽脅迫下(CKp)草木樨幼苗葉片相對含水量顯著降低，較CKn下降了20.99%(P<0.05)(表2)；而相對電導(dǎo)率顯著升高，較CKn上升了139.97%(P<0.05)。不同濃度的NaHS緩解了鹽脅迫對葉片相對含水量及相對電導(dǎo)率的影響，隨NaHS濃度的增加，葉片相對含水量呈先升高后降低的趨勢，而相對電導(dǎo)率則呈先降低后升高的變化，各NaHS濃度下葉片相對含水量與相對電導(dǎo)率差異顯著(P<0.05)。NaHS處理中，葉片相對含水量在0.8 mmol·L-1時(shí)最低，0.1 mmol·L-1時(shí)最高；葉片相對電導(dǎo)率則正好相反，在0.1 mmol·L-1時(shí)最低，在0.8 mmol·L-1時(shí)最高?？梢钥闯?，0.1 mmol·L-1的NaHS顯著緩解了鹽脅迫對草木樨幼苗葉片相對含水量和相對電導(dǎo)率的影響(P<0.05)，相對含水量較CKp增加了26.85%，相對電導(dǎo)率減少了57.54%；與CKn相比較，相對含水量和相對電導(dǎo)率的差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 外源H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

鹽脅迫引起了游離脯氨酸含量的增加，150 mmol·L-1NaCl鹽處理的草木樨幼苗游離脯氨酸含量為299.52 μg·g-1，是空白對照CKn的379.57%(表2)。在NaCl鹽處理中噴施不同濃度的NaHS后，均顯著地抑制了鹽脅迫造成的游離脯氨酸含量的升高(P<0.05)。NaHS處理濃度從小到大的草木樨幼苗的游離脯氨酸含量分別為CKp的84.29%、55.77%、26.80%、26.52%、45.14%和70.99%。各處理以0.1和0.2 mmol·L-1的NaHS對鹽脅迫造成游離脯氨酸含量升高的抑制效果最佳，其脯氨酸含量分別為未受脅迫的CKn的1.02倍和1.01倍，三者間差異不顯著(P>0.05)。

空白對照CKn草木樨幼苗的可溶性糖含量為6.21 mg·g-1，150 mmol·L-1NaCl處理的為3.65 mg·g-1，鹽脅迫使得草木樨幼苗體內(nèi)可溶性糖含量顯著下降(P<0.05)(表2)。噴施NaHS后可以增加草木樨幼苗體內(nèi)可溶性糖的積累，不同濃度NaHS處理的效果不同，總體上隨著濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。各濃度處理?xiàng)l件下，0.1 mmol·L-1時(shí)草木樨體內(nèi)可溶性糖含量最高，為6.10 mg·g-1；而0.8 mmol·L-1時(shí)最低，為3.32 mg·g-1，是單純鹽脅迫的90.96%，且可溶性糖從0.4 mmol·L-1時(shí)即開始低于CKp。說明適宜濃度的NaHS可以緩解鹽脅迫造成的可溶性糖含量的下降，但是施用NaHS的濃度過高，會(huì)使可溶性糖的含量降得更低。

鹽脅迫降低了草木樨幼苗中的可溶性蛋白含量，150 mmol·L-1NaCl脅迫下可溶性蛋白含量是未受脅迫的對照CKn的52.79%(表2)；施加NaHS可以抑制鹽脅迫造成的草木樨可溶性蛋白含量的降低，但濃度達(dá)到0.8 mmol·L-1時(shí)，可溶性蛋白含量降至最低，與單純鹽處理間差異不顯著(P>0.05)，說明該濃度未能緩減鹽脅迫對可溶性蛋白含量的作用。不同濃度NaHS處理的草木樨幼苗的可溶性蛋白含量在62.42～108.12 mg·g-1，總體上隨濃度增大表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；除0.8 mmol·L-1NaHS處理外，其余濃度均顯著高于單純NaCl鹽處理(P<0.05)，各濃度處理下以0.1 mmol·L-1的NaHS處理對可溶性蛋白含量降低的抑制效果最好。

2.3 外源H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

與正常條件下的草木樨幼苗相比，鹽脅迫使得草木樨幼苗中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性均發(fā)生不同程度的降低，且降低程度顯著(P<0.05)(圖1)。噴施NaHS可以明顯緩解抗氧化酶活性的降低(P<0.05)，NaHS濃度為0.025、0.05、0.1 mmol·L-1時(shí)，SOD、POD、CAT活性都逐漸升高，當(dāng)濃度到達(dá)0.1 mmol·L-1(POD是在0.2 mmol·L-1)之后，抗氧化酶活性開始逐漸下降，但均高于CKp或與CKp接近。這說明150 mmol·L-1的NaCl使草木樨幼苗的SOD、POD、CAT活性下降，而噴施0.025～0.8 mmol·L-1的NaHS均能使抗氧化酶活性有所升高，提高其抗鹽能力，不同濃度處理以0.1 mmol·L-1左右時(shí)的作用效果最好。

表2 H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗相對含水量、相對電導(dǎo)率及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of sodium hydrogen sulfide on relative water content, relative electrical conductivity, and osmotic adjustment content in sweet clover seedling under salt stress

同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different treatments at the 0.05 level.

圖1 H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Fig. 1 Effect of sodium hydrogen sulfide on antioxidant enzyme activity and MDA content in sweet clover seedling under salt stress

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，圖2同。

Different lowercase letters indacate significant difference between different treatments at the 0.05 level; similarly for the figure 2.

未經(jīng)NaCl脅迫的草木樨幼苗中丙二醛(MDA)含量為1.65 μg·g-1，經(jīng)NaCl脅迫后其MDA含量則升高到2.83 μg·g-1，是前者的1.72倍。對NaCl脅迫下的草木樨幼苗噴施不同濃度NaHS，MDA含量呈先降低后升高的趨勢；其中噴施0.1 mmol·L-1的NaHS，其MDA含量在經(jīng)NaCl處理的草木樨幼苗中最低，說明0.1 mmol·L-1的NaHS能較好緩解150 mmol·L-1的NaCl造成的MDA含量的升高(圖1)。

2.4 外源H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗葉片葉綠素含量的影響

未受鹽脅迫的草木樨幼苗葉綠素a、b含量最高，其次為0.1 mmol·L-1NaHS處理，最低的則是0.8 mmol·L-1NaHS處理。單純150 mmol·L-1的NaCl脅迫使草木樨幼苗的葉綠素a含量和葉綠素b含量顯著降低(P<0.05)，分別為CKn的54.11%和54.22%(圖2)。外源NaHS的添加有利于葉綠素a、b的合成，緩減鹽脅迫引起的葉綠素a、b含量的降低。不同濃度NaHS處理下葉綠素a、b含量間差異明顯，隨濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其中Ⅲ處理和Ⅳ處理中葉綠素a的含量分別是CKn的87.78%、68.30%，葉綠素b的含量分別是CKn的87.45%、68.05%。因此，0.1和0.2 mmol·L-1的NaHS處理可以顯著緩解鹽脅迫，增加草木樨幼苗的葉綠素a和葉綠素b含量。

圖2 H2S對鹽脅迫下草木樨幼苗葉綠素含量的影響Fig. 2 Effect of sodium hydrogen sulfide on chlorophyll content in sweet clover seedling under salt stress

2.5 隸屬函數(shù)法對鹽脅迫下草木樨幼苗的綜合評價(jià)

利用隸屬函數(shù)法，對8個(gè)處理草木樨幼苗的生理及抗氧化酶活性等12個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。各指標(biāo)中除相對電導(dǎo)率、游離脯氨酸和丙二醛與幼苗生長狀況呈負(fù)相關(guān)關(guān)系外，其余指標(biāo)與幼苗生長狀況均為正相關(guān)關(guān)系，帶入計(jì)算公式得出表3，表中數(shù)值越高幼苗生長狀況越好。從表中可以看出CKn組幼苗生長狀況最好，其次為Ⅲ組，最差的為CKp組，Ⅵ組接近于CKp。說明鹽脅迫嚴(yán)重危害了草木樨幼苗的正常生長，而0.1 mmol·L-1NaHS處理極大地緩解了鹽脅迫對幼苗各指標(biāo)造成的影響，使得幼苗能夠正常生長，但是濃度過高或過低時(shí)，緩解效果都會(huì)大大減弱。

表3 各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及綜合排序Table 3 The membership function of each index value and comprehensive ranking

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞膜是活細(xì)胞和環(huán)境之間的界面和屏障，各種不良環(huán)境對細(xì)胞的影響往往首先作用于細(xì)胞膜[23]。相對電導(dǎo)率反映了植物細(xì)胞膜透性的大小，植物受到的損傷越嚴(yán)重葉片相對電導(dǎo)率值越大，反之則越小[24]。本研究中，草木樨幼苗在150 mmol·L-1的NaCl處理下相對含水量下降、相對電導(dǎo)率升高，說明此時(shí)草木樨受到了鹽脅迫，細(xì)胞失水，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損，膜透性增大；而不同濃度的NaHS處理使得葉片相對水量增大，相對電導(dǎo)率下降，因而，可以認(rèn)為信號分子H2S可以在一定程度上幫助草木樨對抗鹽脅迫，并通過維持較高相對含水量和減小細(xì)胞膜透性的方式緩解鹽脅迫造成的傷害。

滲透調(diào)節(jié)是植物在逆境條件下，通過代謝活動(dòng)增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低其滲透勢而保持繼續(xù)吸水，維持較正常的代謝活動(dòng)[25]。植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)很多，本研究主要研究了游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量變化。游離脯氨酸含量的積累是植物滲透調(diào)節(jié)的重要部分，當(dāng)植物遭受非生物脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生比平時(shí)更多的脯氨酸用以維持細(xì)胞滲透平衡[26]和抵抗逆境脅迫[27]。從研究結(jié)果來看，NaCl脅迫使草木樨幼苗中游離脯氨酸含量顯著增加，NaHS處理則能降低其含量的增加,說明H2S緩解了鹽脅迫造成的傷害，草木樨用來抵抗鹽脅迫而產(chǎn)生的脯氨酸含量減少(表2)。可溶性糖是植物體內(nèi)主要的儲能物質(zhì)，是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，對逆境條件下的植物細(xì)胞起滲透調(diào)節(jié)作用[27]。研究表明，在脅迫環(huán)境下，植物所含的可溶性糖含量會(huì)大幅降低，可溶性糖含量越低植物所受脅迫越嚴(yán)重[28]。本研究中150 mmol·L-1的NaCl脅迫使草木樨幼苗中可溶性糖含量顯著降低，這與前人研究[27-28]結(jié)果相同，鹽脅迫的同時(shí)外施NaHS又可提高其含量，說明植物受脅迫程度可以通過施用NaHS得到緩解。可溶性蛋白含量也是滲透調(diào)節(jié)的重要指標(biāo)之一[29]，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定值時(shí)，植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低[30]。本研究中，單純鹽處理的草木樨幼苗中可溶性蛋白含量最低，0.1 mmol·L-1NaHS處理中含量則接近于未受鹽脅迫的含量，這可能是由于H2S解除了鹽脅迫對某些蛋白質(zhì)合成途徑的抑制，同時(shí)降低了蛋白質(zhì)的水解，使可溶性蛋白含量保持較高水平。

抗氧化酶活性及丙二醛含量的變化顯示了植物抗氧化損傷程度，是研究植物非生物脅迫的重要指標(biāo)[31]。鹽脅迫條件下，植物細(xì)胞線粒體和葉綠體電子傳遞中的泄露電子積累，刺激活性氧大量產(chǎn)生，過量的活性氧使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物分子氧化降解，導(dǎo)致酶失活，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷和膜結(jié)構(gòu)損傷[32]。膜脂過氧化產(chǎn)生的丙二醛則可通過與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)或影響纖維素分子間的橋鍵而抑制蛋白質(zhì)的合成[33]。研究中，NaHS在溶液中分解為Na+和HS-，HS-結(jié)合H+形成H2S，H2S透過細(xì)胞膜擴(kuò)散，迅速到達(dá)線粒體和葉綠體基質(zhì)作用于草木樨的抗氧化酶體系，提高抗氧化酶活性。這恰是H2S作用并提高抗氧化酶活性的本質(zhì)[34-36]。在抗氧化酶體系中，SOD以O(shè)2-為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)，將毒性較強(qiáng)的O2-轉(zhuǎn)化為毒性較輕的H2O2，然后CAT將H2O2歧化為H2O和O2，同時(shí)POD利用各種基質(zhì)作為電子供體將H2O2還原為H2O[37]。正是通過這一系列的過程，草木樨幼苗中的過量活性氧被清除，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷降低，膜脂過氧化的產(chǎn)物丙二醛含量降低。從試驗(yàn)結(jié)果來看，NaHS對抗氧化酶活性的提高是有劑量效應(yīng)的，隨濃度的增大先升高后降低，當(dāng)噴施濃度過高時(shí)反而抑制了草木樨抗氧化酶活性，MDA含量又有所增加(圖1)，使得細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷和膜結(jié)構(gòu)損傷，這一點(diǎn)可為試驗(yàn)中0.8 mmol·L-1的NaHS處理下相對電導(dǎo)率增大，且與鹽脅迫處理相近所證實(shí)(表2)。

因此可以得出結(jié)論，1)NaHS處理可提高NaCl脅迫下草木樨幼苗葉片相對含水量，降低葉片相對電導(dǎo)率，以此緩解對草木樨細(xì)胞膜的危害；NaHS處理可降低因鹽脅迫而造成的游離脯氨酸的積累，促進(jìn)可溶性糖含量與可溶性蛋白含量的增加，增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，增加葉片中的葉綠素含量；2)不同濃度NaHS處理對緩解草木樨的NaCl鹽脅迫效果差異顯著，隨濃度的增加，各指標(biāo)的變化并不相同，但各指標(biāo)均顯示出一定的劑量效應(yīng)。采用隸屬函數(shù)法對不同處理的綜合效應(yīng)的評價(jià)表明，對于NaCl鹽脅迫(150 mmol·L-1)的草木樨幼苗，6種NaHS緩解鹽脅迫濃度處理，以0.1 mmol·L-1的緩解效果最好，其次為0.2 mmol·L-1，而0.8 mmol·L-1緩解效果最差。