龍 芳，文 芳，聶 蕾，張其柱，吳章穎，訾 聃△，張家龍，李 誼

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產科，貴陽 550004； 2．貴州省六盤水市婦幼保健院婦產科 553000；3.貴州省六盤水市人民醫(yī)院病理科 553000；4.貴州省六盤水市婦幼保健院病理科 553000)

卵巢惡性腫瘤是我國女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，資料顯示，卵巢腫瘤發(fā)病率越來越高，對婦女生命造成嚴重威脅。在全球范圍內，每年有12.5萬人死于卵巢腫瘤[1]，2010年我國因卵巢癌死亡的病例約1.76萬例[2]。卵巢腫瘤形成過程中存在著包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調控基因的失調等各類基因表達的異常情況發(fā)生，同時研究發(fā)現(xiàn)腫瘤易發(fā)生細胞侵襲轉移的特性與趨化因子受體可促進腫瘤的生長、血管的生成及腫瘤的遠處轉移密切相關[3]。有足夠的原始研究性文章可以證實趨化因子12(CXCL12)/CXCR4 在腫瘤細胞的凋亡過程中起到非常關鍵的作用。在眾多凋亡控制基因中，B淋巴細胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)蛋白家族和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)家族最受關注，目前國內外對于CXCR4與細胞凋亡相關因子(Bcl-2、Bax、caspase-3)聯(lián)合研究較少，故本研究希望為卵巢癌的靶向治療提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織及細胞來源 選擇貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院、貴州省六盤水市婦幼保健院病理科及貴州省六盤水市人民醫(yī)院病理科存檔石蠟標本上皮性卵巢癌患者39例為惡性組，其中早期(FIGO Ⅰ、Ⅱ)卵巢癌26例，晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ)卵巢癌13例，漿液性癌35例，黏液性癌4例，年齡29～72歲，中位年齡49歲。選擇同一時期40例卵巢良性上皮腫瘤患者手術切除標本作為良性對照組。卵巢癌細胞株OVCAR3購自昆明醫(yī)科大學細胞庫中心。

1.2主要試劑 DMEM高糖、胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、雙抗(美國Hyclone)，胎牛血清(德國PAN Bitech公司)，CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3多克隆抗體(英國Abcam公司)，AMD3100(美國Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 卵巢癌細胞株OVCAR3常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，PBS沖洗2～3次，0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代。細胞分為3組：陰性對照組(PBS)、AMD3100 10 μg/mL組及AMD3100 100 μg/mL組。

1.3.2免疫組織化學法 收集的標本均經10%中性甲醛固定，常規(guī)切片行蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組織化學染色方法按試劑盒說明書進行，每批染色均用PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照片由武漢博士德生物工程有限公司提供。采用雙盲閱片，半定量積分法判定結果。以細胞核、細胞膜或細胞質呈黃色顆粒為陽性，每張切片于高倍鏡下選10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞百分比小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色呈淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。以上兩項評分的乘積小于3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.3.3Western blot檢測CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平 取對數(shù)生長期細胞，置于無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，提取OVCAR3細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后脫脂，室溫封閉2 h后加入一抗抗體，4 ℃過夜，TBST漂洗后，分別加二抗孵育，后用TBST漂洗，加入DAB顯色液，待陽性區(qū)帶顯色清晰后拍照記錄。

1.3.4細胞凋亡實驗 選擇對數(shù)生長期細胞，胰酶消化,制備成細胞懸液，計數(shù)板計數(shù)，取含10萬個細胞以上的細胞懸液，PBS溶液重懸加入Annexin溶液混勻，室溫避光孵育10～15 min，離心，PBS 洗滌細胞，重懸細胞，加入碘化丙啶(PI)染色細胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式細胞儀分析凋亡率。

2 結 果

2.1CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在惡性組及良性對照組中的表達 免疫組織化學染色顯示惡性組CXCR4、Bcl-2的表達高于良性對照組，Bax表達低于良性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；caspase-3在惡性組和良性對照組中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；惡性組CXCR4蛋白的表達與Bcl-2呈正相關(r=0.480,P<0.05)，與caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.475，P<0.05)。Bax、Bcl-2之間無相關性(P>0.05)，見表1，圖1。

表1 CXCR4、Bcl-2、Bax 及caspase-3在兩組腫瘤中的表達(n)

圖1 EXCR4、Bax、Bcl-2、caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達(免疫組織化學×200)

項目nCXCR4-+χ2PBcl-2-+χ2P年齡(歲)0.4420.6471.0910.296 ≤603415191222 >6053232病理分級(期)9.6120.00212.4420.000 G1～G21111092 G3281711622病理類型1.5320.3180.3600.548 漿液性3515201421 黏液性43113淋巴結轉移14.3150.00011.8300.001 陰性18144126 陽性21417318大網膜轉移7.6390.0067.8310.005 陰性13103 94 陽性26818620腹水癌細胞0.1990.7527.4620.006 陰性1899117 陽性21912417臨床分級(級)7.6390.0060.0110.918 Ⅰ+Ⅱ13103914 Ⅲ+Ⅳ26818610CA125(IU/L)5.3720.0352.368 0.124 ≥353212201418 <3576116

續(xù)表2 上皮性卵巢癌組織中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達與臨床病理特征的關系

續(xù)表2 上皮性卵巢癌患者中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達與臨床病理特征的關系

2.2CXCR4、Bcl-2、Bax和caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達與臨床病理特征的關系 CXCR4在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、大網膜轉移、臨床分期、CA125水平有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、腹水中是否找到癌細胞無關(P>0.05)；Bcl-2在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、大網膜轉移、腹水中是否找到癌細胞有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、CA125水平無關(P>0.05)。Bax 在上皮性卵巢癌組織中的表達與淋巴結轉移、CA125水平有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、腹水中是否找到癌細胞、大網膜轉移、病理分級無關(P>0.05)；caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達與病理分級、淋巴結轉移、臨床分期有關(P<0.05)；與年齡、病理類型、大網膜轉移、腹水中是否找到癌細胞、CA125水平無關(P>0.05)，見表2。

A:Western blot圖；B：定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖2不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞CXCR4的

蛋白表達水平的影響

A：Western blot圖；B～D：Bax、Bcl-2、caspase-3定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖3不同濃度AMD3100對卵巢瘤細胞Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達情況

2.3不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組CXCR4蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陰性對照組比較，Bax、caspase-3蛋白表達升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2、3。隨著AMD3100濃度增大，Bcl-2/Bax值變小，見圖4。

2.4不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞凋亡的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 不同濃度AMD3100對卵巢癌細胞Bax/Bcl-2的影響

A：陰性對照組；B:AMD3100 10 μg/mL組;C:AMD3100 100 μg/mL組;D:凋亡分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖5流式細胞術檢測OVCAR3細胞凋亡

4 討 論

卵巢癌是女性患者中常見的癌癥，超過半數(shù)以上的卵巢癌病理類型為上皮性卵巢癌。該病起病隱匿，大多數(shù)患者初次就診時即為晚期，且十分容易轉移[4]，其病死率占婦科惡性腫瘤的第1位。可見，了解相關的分子調控機制在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞會高表達趨化因子受體CXCR4，其與配體趨化因子CXCL12構成的 CXCL12-CXCR4 生物學軸，與腫瘤細胞的增殖、散播、免疫排斥反應及腫瘤的新生血管形成有關[5-7]，因此，本研究檢測在人體上皮性卵巢癌組織中CXCR4及相關凋亡因子的表達，同時利用CXCR4的抑制劑AMD3100，在細胞實驗中靶向阻斷CXCR4后觀察其對卵巢癌細胞凋亡的影響。

細胞凋亡是一種細胞主動性死亡方式?，F(xiàn)在認為腫瘤可能是細胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細胞繼續(xù)存在產生的。常見的凋亡基因有Bcl-2家族、p53家族和caspase家族等。目前已經發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族按功能可分為兩類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2；而另一類具有促進凋亡作用，如Bax。研究表明激活Bax基因能促進SKOV3細胞凋亡[8]，Bcl-2對大鼠海馬神經元凋亡有抑制作用[9]。caspase-3作為凋亡caspase依賴途徑中的中心分子，對調亡過程起著級聯(lián)放大作用，是大家公認的細胞凋亡下游關鍵執(zhí)行者，有研究發(fā)現(xiàn)它能有效地阻止血管新生，從而阻止腫瘤的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織CXCR4、Bcl-2的表達高于良性腫瘤組織，Bax表達低于良性腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；說明CXCR4、Bcl-2、Bax的表達與腫瘤的發(fā)生有密切關系。研究表明表達CXCR4的SGC7901胃癌細胞在 CXCL12 的作用下可能激活 PI3K/Akt 信號途徑，增強胃癌細胞的抗凋亡作用[10]。通過下調卵巢癌細胞株中CXCR4 的表達，能促進卵巢癌細胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌細胞的侵襲能力[11]。筆者推測CXCR4的高表達可以降低細胞的凋亡能力，從而參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移。本研究在進一步研究CXCR4及凋亡相關因子的表達水平與患者臨床病理特征的關系時發(fā)現(xiàn)CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達均與淋巴結轉移有關，而淋巴結轉移是評定卵巢癌預后的重要指標之一，說明4者均參與了上皮性卵巢癌的侵襲與轉移。相關性分析發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白的表達與Bcl-2呈正相關，而與caspase-3蛋白表達呈負相關，說明CXCR4可能通過某種途徑來調控Bcl-2與caspase-3，此結果與有關報道相一致[12-13]。

AMD3100是一個高度特異性的細胞因子受體拮抗劑，選擇性抑制CXCL12與CXCR4結合，阻斷CXCL12、CXCR4生物軸的生理功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。在本研究中，采用Western blot檢測CXCR4的表達，發(fā)現(xiàn)隨著AMD3100濃度的增大，CXCR4的表達明顯受到抑制，再次證實了AMD3100可以靶向阻斷CXCR4的表達。同樣有研究發(fā)現(xiàn)AMD3100作用人淋巴瘤細胞株Ramos細胞后，隨著藥物濃度的增加，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，凋亡增加[15]。AMD3100能夠誘導乳腺癌細胞及直腸癌細胞的凋亡，并能有效地降低其增殖與遷移能力[16]。也能夠引起骨髓細胞的凋亡的同時減少腫瘤血管的灌注[17]。說明CXCR4可能通過某種路徑對凋亡基因進行調控，從而參與腫瘤細胞凋亡過程。張丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)降低Bcl-2/Bax比值可誘導SMMC-7721細胞凋亡，抑制細胞增殖可能的機制為Bcl-2/Bax值相當于啟動細胞凋亡的“分子開關”，Bax增高可促進細胞凋亡；Bcl-2升高可抑制細胞凋亡。因此，有研究推斷，Bcl-2與Bax的比值決定著細胞受凋亡刺激后的生存能力。在本研究中，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示：隨著AMD3100濃度的增大，Bcl-2/Bax值變小，細胞凋亡率增加。caspase-3在機體中與別的凋亡蛋白家族成員發(fā)揮相互作用，通過降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，激活caspase家族成員發(fā)生水解，產生級聯(lián)反應，最終導致DNA在核小體連接處被分割成DNA鏈接片段，細胞凋亡由此發(fā)生。在本研究中，隨著AMD3100濃度的增加，caspase-3的表達增加，細胞凋亡明顯增加，此結果與龐雪利等[19]研究結果相一致。故可推測，CXCR4可能通過某種途徑調控Bax/Bcl-2值的變化，同時上調caspase-3的表達，因此筆者推測阻斷CXCR4的表達，可以誘導細胞的凋亡。

卵巢癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，治療后易復發(fā)的特點是臨床治療的一個難點。本研究表明，利用特異性抑制劑AMD3100對CXCR4進行靶向阻斷，增加了細胞凋亡，其機制可能是通過阻斷CXCR4后抑制凋亡相關蛋白Bcl-2的表達，同時促進Bax、caspase-3表達實現(xiàn)的。這或許能成為卵巢癌治療的一個新的理論依據(jù)，但其確切的作用機制有待進一步深入研究。