王 濤，劉宏祥，王 穎，齊 姣，史小盼，王 丹

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，河北保定 071000)

缺血性腦卒中屬于臨床常見腦損傷疾病，近年來發(fā)病率逐漸升高，對人類健康造成嚴重的威脅，給患者帶來經(jīng)濟、心理負擔(dān)[1]。近年來中藥在治療腦出血方面取得較好的療效，其中清熱化痰解毒方具有清熱解毒效果，在腦缺血治療中應(yīng)用較多[1]。硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP)是機體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激因子，在心肌缺血及腦缺血中研究較多，有文獻報道機體處于疾病狀態(tài)時，其能夠結(jié)合NALP3炎性體，激活NALP3信號通路，進而激活炎性反應(yīng)導(dǎo)致腦梗死[2]。然而清熱化痰解毒方對TXNIP/NLRP3通路的作用機制，目前尚不清楚。本研究通過制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察清熱化痰解毒方預(yù)處理后對大鼠神經(jīng)功能及TXNIP/NLRP3通路的影響，以探究清熱化痰解毒方的藥理機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF清潔級SD大鼠90只，8周齡，體質(zhì)量200～260 g，由北京生命科學(xué)研究所動物實驗中心提供，合格證號SYXK(京)2015-0002，所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25 ℃，濕度為60%。本研究經(jīng)北京動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，批號為IACUC-01(20160917)。

1.2藥品及試劑 清熱化痰解毒方(主要成分：瓜蔞10 g，郁金10 g，石菖蒲10 g，蒲公英10 g，丹參10 g，桔梗10 g，杏仁10 g，射干10 g，川貝10 g，黃芩10 g，均購自于張仲景大藥房)；尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司；批號D14202003034；規(guī)格10 mL/2 mg)；三苯基氯化四氮唑(Amresco 公司，批號298964)；TXNIP、NLRP3兔抗鼠單抗(英國Abcam公司,批號分別為14623S、14781S)；凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)、白細胞介素1β(IL-1β)、半胱天冬酶1(caspase-1)兔抗鼠單抗(美國Santa Cruz公司，批號分別為752610、752916、753304)；羊抗鼠IgG二抗(上海容創(chuàng)生物科技有限公司，批號RJC1793)；蘇木素染液、伊紅染液(美國Sigma公司，批號YYJK-923、230251)；BCA試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Genecopoeia公司)；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡(上海普赫生物科技有限公司)；CFX96 PCR儀(美國BioRad公司)；GIS-500凝膠成像儀(杭州Miulab公司)。

1.3方法

1.3.1動物分組與給藥 所有大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平預(yù)處理組(8.0 mg/kg)，清熱化痰解毒方低、中、高劑量預(yù)處理組，每組15只預(yù)處理組大鼠在進行造模前3天開始每天2次(每天上午9：00和下午16:00)灌胃給藥，最后一次給藥于造模前3 h，共計給藥7次，假手術(shù)組、模型組大鼠均灌胃等量0.9%生理鹽水。預(yù)處理對應(yīng)給藥劑量為成人的6.25倍，所有大鼠平均體質(zhì)量220 g，則大鼠每天給藥劑量為 6.5 mg/kg，設(shè)置清熱化痰解毒方低、中、高劑量藥物劑量為6.5、13.0、26.0 mg/kg，尼莫地平給藥劑量為8.0 mg/kg。

1.3.2腦缺血再灌注損傷模型大鼠制備 于大鼠腹腔注射10% 3.5 mg/kg水合氯醛麻醉，參考文獻[3]，依次使右頸總動脈及頸外、頸內(nèi)動脈暴露，在頸外動脈遠端處結(jié)扎，在其殘端處插入直徑為0.24 mm栓線，穿過頸總動脈進入內(nèi)動脈，進而阻斷大腦中動脈血流，持續(xù)10 min后，完成預(yù)缺血處理。3 d后重新麻醉大鼠，并推進栓線，2 h后將栓線完全抽出，模型制備結(jié)束。假手術(shù)組大鼠僅進行右頸總動脈分離處理。

1.3.3大鼠神經(jīng)功能缺損評分 造模后待大鼠醒后觀察其行為變化，參照LONGA[4]分級法對神經(jīng)功能進行評定，大鼠無神經(jīng)功能缺損為0分；出現(xiàn)不能完全伸展對側(cè)前爪等輕度神經(jīng)功能缺損為1分；行走出現(xiàn)對側(cè)旋轉(zhuǎn)等輕中度神經(jīng)功能缺損為2分；行走出現(xiàn)對側(cè)傾倒等輕重度神經(jīng)功能缺損為3分；意識完全喪失，不能行走為4分。重復(fù)評定3次，取平均值作為最終評分，評分為1～3分說明模型制備成功。

1.3.4大鼠腦梗死面積測定 造模后24 h，隨機選取6只大鼠，斷頭取腦后，將額極、枕極切除，沿冠狀切面切割為5片，置于2%三苯基氯化四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，放置37 ℃恒溫水浴鍋中，黑暗下孵育30 min，染色均勻后，棄去TTC，將腦切片放置于4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h，拍照后，采用Image pro軟件進行分析處理，計算大鼠腦梗死面積。腦梗死面積=全腦梗死面積/全腦片面積×100%。

1.3.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化[5]造模后選取6只大鼠,處死后將腦組織放置于4%多聚甲醛溶液固定，制備石蠟切片，在二甲苯中固定30 min，隨后在質(zhì)量分數(shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別脫水5 min；蒸餾水沖洗后，加入蘇木素染色10 min，隨后置于1%鹽酸5 s后，蒸餾水進行沖洗。滴加伊紅染液進行復(fù)染5 min，在不同濃度的乙醇溶液中脫水2 min，加入二甲苯進行透明處理，滴加中性樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.3.6RT-PCR法檢測腦皮質(zhì)中NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 mRNA表達 大鼠處死后取大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)，參照RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物序列見下表1。反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Mix 10.0 μL，H2O 8.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,10×cDNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性10 s、60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 2 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以GADPH作為內(nèi)參基因根據(jù)2-ΔΔCt算法計算各組mRNA表達水平。

表1 PCR引物序列

1.3.7Western blot檢測腦皮質(zhì)中 TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1蛋白表達 將缺血側(cè)腦皮質(zhì)剪碎，添加蛋白裂解液置于冰上放置30 min，離心后收集上清液，參照BCA試劑盒測定腦皮質(zhì)蛋白總濃度，配制10%分離膠和5%濃縮膠，取50 μg蛋白上樣進行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，結(jié)束后用TBST溶液清洗，加入5%脫脂牛奶室溫下進行1 h封閉，TBST溶液清洗后，加入一抗(TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1抗體,稀釋倍數(shù)1∶500)，4 ℃過夜，TBST溶液清洗后加入羊抗鼠IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶10 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗后ECL顯色后置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達情況。

2 結(jié) 果

2.1清熱化痰解毒方對大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響 假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為0、(2.56±0.48)、(1.47±0.29)、(2.02±0.31)、(1.75±0.27)、(1.35±0.19)分。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評分均下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2清熱化痰解毒方對大鼠腦梗死面積的影響 假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組大鼠腦梗死面積分別為0、(33.47±3.21)%、(9.38±1.26)%、(26.36±3.19)%、(15.74±3.27)%、(11.26±2.13)%。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組和清熱化痰解毒方低、中、高劑量組大鼠腦梗死面積均下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平組；D：清熱化痰解毒方低劑量組；E：清熱化痰解毒方中劑量組；F：清熱化痰解毒方高劑量組

圖1各組大鼠腦組織TTC染色情況

2.3清熱化痰解毒方對大鼠腦皮質(zhì)組織病理學(xué)的影響 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)細胞未出現(xiàn)明顯病理學(xué)損害，細胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密。模型組大腦皮質(zhì)細胞出現(xiàn)明顯破裂、排列紊亂，細胞核固縮，且周圍出現(xiàn)較大空泡，細胞明顯壞死；清熱化痰解毒方各劑量組細胞損害有所降低，隨著藥物處理濃度的升高，細胞出現(xiàn)腫脹減輕，壞死細胞數(shù)量逐漸減少，見圖2。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平組；D：清熱化痰解毒方低劑量組；E：清熱化痰解毒方中劑量組；F：清熱化痰解毒方高劑量組

圖2清熱化痰解毒方對大鼠腦皮質(zhì)組織病理學(xué)的影響(HE×100)

2.4清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 mRNA的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)中NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組NLRP3、IL-1β、ASC、caspase-1 mRNA表達降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.5清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1蛋白的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組TXNIP、NLRP3、IL-1β、ASC、caspase-1蛋白表達降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

2.6清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1蛋白陽性表達率的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 蛋白陽性表達率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，尼莫地平組，清熱化痰解毒方低、中、高劑量組TXNIP、NLRP3、IL-1β、ASC、caspase-1蛋白陽性表達率降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平組；D：清熱化痰解毒方低劑量組；E：清熱化痰解毒方中劑量組；F：清熱化痰解毒方高劑量組

圖3 清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1蛋白的影響

a:P<0.01,與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較

表3 清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1、β-actin蛋白表達影響±s)

a:P<0.01,與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較

表4 清熱化痰解毒方對腦皮質(zhì)中TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1蛋白陽性表達率的影響±s，%)

a:P<0.01,與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較

3 討 論

腦缺血發(fā)生率、致死率較高，以往臨床上治療腦缺血常用的方式為溶栓，但其容易引發(fā)缺血再灌注損傷，加重病情。TXNIP介導(dǎo)的NLRP3信號通路在缺血性灌注損傷中發(fā)揮重要作用[6-7]。目前在早期心肌缺血再灌注損傷中已對TXNIP/NLRP3信號通路進行研究，抑制該通路后能夠保護小鼠缺血再灌注心肌受損[8]，但在腦缺血再灌注損傷中研究較少，本研究通過對腦缺血再灌注損傷大鼠采用清熱化痰解毒方預(yù)處理，觀察大鼠神經(jīng)功能及TXNIP/NLRP3通路的變化，以探究清熱化痰解毒方治療的分子機制，為腦缺血再灌注損傷治療提供一定的參考。

NLRP3是機體內(nèi)識別免疫系統(tǒng)病原體的重要蛋白，其能夠在ATP、病毒、尿酸鈉誘導(dǎo)下激活，促進其C端結(jié)構(gòu)LRR與配體結(jié)合，改變NALP3結(jié)構(gòu)，促進ASC、caspase-1集合形成復(fù)合物活化caspase-1，促使IL-1β成熟并分泌至細胞外引發(fā)炎性反應(yīng)，進而在多個系統(tǒng)、器官中發(fā)揮致病作用[7-9]。王敏等[10]研究顯示在腦組織小膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞中均有NLRP3炎性體表達。在心肌缺血模型研究中顯示心肌纖維細胞中NLRP3表達水平升高會加劇缺血性再灌注損傷程度[11]。而在腦缺血再灌注損傷發(fā)生中NLRP3信號通路的作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示NLRP3信號通路中NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1表達均升高，提示NLRP3炎性體可能參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，通過給予尼莫地平、大鼠清熱化痰解毒方預(yù)處理顯示NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1表達成劑量依賴性降低，并且大鼠腦神經(jīng)缺損評分及腦梗死面積也降低，說明清熱化痰解毒方可通過抑制NLRP3減輕腦缺血再灌注損傷程度，進而對大鼠腦組織發(fā)揮保護作用，效果與尼莫地平相似。

TXNIP屬于機體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)硫氧還蛋白中重要一員，主要發(fā)揮氧化應(yīng)激作用，近期有研究發(fā)現(xiàn)在機體處于疾病狀態(tài)下，TXNIP可結(jié)合NLRP3使其發(fā)生活化，進而激活NLRP3信號通路[12]。本研究結(jié)果顯示，大鼠TXNIP/NLRP3信號通路中關(guān)鍵蛋白mRNA、蛋白及蛋白陽性表達率均降低，提示清熱化痰解毒方可能抑制TXNIP的表達進而抑制NLRP3信號通路，說明TXNIP/NLRP3信號通路可能參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果提示清熱化痰解毒方預(yù)處理能夠抑制TXNIP/NLRP3通路，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，這可能為其作用機制之一，為臨床腦缺血再灌注損傷治療提供了一定的參考。但本研究也存在一定的不足，并未在研究中設(shè)計通路抑制劑進行驗證，這還有待后續(xù)深入研究。