范銘，劉哲，曹艷，陸勝民,*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所， 浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310021)

桑葚屬于?？?，被列入藥食同源名錄，鮮果味道甜美、多汁，含有人體所必需的營養(yǎng)素如維生素、氨基酸、礦物質以及具有生理活性的花色苷、黃酮、酚酸類化合物。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增強免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著的作用[1-2]。目前，桑葚的加工主要以制作果汁為主，少量用于釀造果酒、果醋，榨汁后所產生的果渣一般被廢棄，造成環(huán)境污染和資源浪費。然而桑葚渣中仍殘留大量花色苷、多酚和黃酮等活性成分，因此可用于開發(fā)營養(yǎng)健康食品[3]。由于水分含量和殘?zhí)橇烤^高，桑葚渣極易變質和腐敗，需要對其進行及時干燥處理或冷凍保存。本文主要考察不同干燥方式和乙醇提取濃度對桑葚渣中主要功能成分和α-淀粉酶抑制率的影響，為桑葚渣開發(fā)成具有降糖活性的產品提供技術和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為桑葚品種大十，采摘于浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)馬村。榨汁后的桑葚渣以每袋500 g進行分裝，保存于-20 ℃的冰箱中，備用。

1.2 儀器

DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗室備有限公司)；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BJ-300多功能粉碎機(拜杰公司)；電子天平；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LXJ-ⅡB型離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1800紫外分光光度計(日本島津公司)；DK-8D電熱恒溫水槽(上海精宏實驗室備有限公司)。

1.3 試劑

乙醇、鹽酸、氯化鉀、冰乙酸、無水乙酸鈉、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、福林酚、沒食子酸、碳酸鈉、可溶性淀粉、阿卡波糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等購于上海國藥集團；α-淀粉酶(豬胰腺淀粉酶)購于源葉生物公司。

1.4 桑葚渣的干燥處理

熱風干燥。稱取在-20 ℃中冷凍的桑葚渣(含水量89%)500 g平鋪于托盤中，鼓風干燥箱中干燥至恒重。干燥條件為50 ℃、48 h。將干燥后的桑葚渣研磨過100目篩(孔徑0.149 mm)，保藏于-40 ℃冷凍冰箱中。

冷凍干燥。稱取在-20 ℃中冷凍的桑葚渣500 g，在-80 ℃預凍1 d，再冷凍干燥。凍干條件：在-80 ℃預凍24 h，再進真空冷凍干燥至恒重，阱溫度-40 ℃左右，真空度0.025 MPa，干燥72 h。將干燥后的桑葚渣研磨過篩，保藏于-40 ℃冷凍冰箱中。

1.5 提取工藝

取冷凍干燥、熱風干燥后的桑葚渣粉各20 g，用乙醇濃度為0、20%、40%、60%、80%，料液比為1∶10進行超聲提取，超聲條件為功率500 w、溫度60 ℃，提取時間為30 min，提取液在4 000 r·min-1離心20 min，取上清。上述過程重復2次，合并濾液。

1.6 提取液中活性成分的測定

1.6.1 總黃酮含量

參照文獻[4]。

標準曲線的建立。精密稱取無水蘆丁標準品適量，加無水乙醇制成0.2 mg·mL-1的標準品溶液。精密吸取該溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻，靜置6 min，加NaOH溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，放置15 min，在509 nm波長處測定吸光值。平行試驗2～3次。

樣品的測定。精密吸取提取液2.5 mL置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加NaOH溶液10 mL, 搖勻，加水至刻度，放置15 min，在509 nm波長處測定吸光值，以蒸餾水做空白。

現在家長對于孩子發(fā)熱越來越恐懼了，因此孩子只要發(fā)熱或者發(fā)熱持續(xù)一天或兩天，家長就會帶孩子反復去醫(yī)院就診或者在家私自用藥，不但讓孩子成了藥罐子，同時也埋下耐藥的隱患，而且還容易貽誤病情。為什么家長會有這種表現呢？這主要源于對發(fā)熱缺乏正確的認識。

1.6.2 總酚含量

參照文獻[5]。

標準曲線的制作。分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL濃度為0.1 mg·mL-1的沒食子酸標準溶液于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL Folin Ciocalteu顯色劑，搖勻；再加入5 mL 5%Na2CO3溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm處測定其吸光值。

樣品處理。取1 mL提取液，加入9 mL蒸餾水混勻，加入2.5 mL Folin Ciocalteu顯色劑，搖勻；再加入5 mL 5% Na2CO3溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm處測定其吸光值。平行試驗2～3次。

1.6.3 總花色苷含量

各取1 mL樣品分別加入9 mL pH 1.0的緩沖液(KCl-HCl)和pH 4.5的緩沖液(NaAc-HCl)，分別在510 nm和700 nm處測定其吸光值[6]。平行試驗2～3次。

1.7 α-淀粉酶活性抑制試驗

α-淀粉酶是淀粉消化過程中的一種關鍵酶，水解淀粉結構中的α-1,4糖苷鍵。α-淀粉酶抑制劑能通過抑制腸道內唾液和 α-胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，可有效控制餐后血糖的升高，間接減少體內脂肪的合成，延緩糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。相比于動物和細胞試驗來說，α-淀粉酶活性抑制試驗具有成本較低、操作簡便和可控性強等優(yōu)點。因此本試驗選用α-淀粉酶活性抑制試驗來研究桑葚的降糖活性[7]。

1.8 數據統計

用Excel 2010、SPSS 17.0進行數據分析。試驗重復3次以上，試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 對桑葚渣醇提液活性成分含量的影響

分別選取熱風干燥、冷凍干燥后的桑葚粉為原料，以不同濃度的乙醇溶液(20%、40%、60%、80%)作為提取溶劑，測定各組提取液中總酚、總黃酮、總花色苷的含量。

由表1可知，采用不同方式干燥的桑葚渣在乙醇中釋放活性成分的規(guī)律相同，活性成分含量均隨乙醇濃度的增加先增加后下降，且不同乙醇濃度的桑葚提取液中總黃酮、總酚、總花色苷的含量均呈現顯著性差異。當乙醇體積分數達到60%時，桑葚的活性成分含量達到最大，可能是由于乙醇體積分數小于60%時，提取劑的極性有利于多酚、黃酮、花色苷的溶解，當乙醇體積分數繼續(xù)增加時，提取劑的極性偏弱，不利于多酚、黃酮、花色苷的溶解。這與邢小麗等[4-6]研究的規(guī)律一致。而冷凍干燥的桑葚渣在相同乙醇濃度所提取出的活性成分含量遠高于熱風干燥的桑葚渣，特別是總花色苷的含量，可能由于花色苷極易氧化，冷凍干燥過程中較低的溫度和氧氣含量會降低花色苷的損失，而熱風干燥暴露在空氣中的時間較長，多酚、黃酮、花色苷都易被氧化[9]，所以在冷凍干燥過程中活性物質損失少。因此，冷凍干燥能更好地保存桑葚的活性物質。

表1 不同干燥方式的桑葚渣醇提液中活性成分含量

注：相同干燥方式同列無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 對桑葚渣醇提液抑制α-淀粉酶活性的影響

選取不同濃度乙醇水溶液(20%、40%、60%、80%)為提取劑，探究經冷凍干燥、熱風干燥處理的桑葚渣在各濃度的乙醇水溶液下對α-淀粉酶的抑制活性。

由圖1可知，2種處理方式的醇提液對α-淀粉酶的抑制活性的規(guī)律相似，均隨著乙醇體積分數的增大先增高后趨于平穩(wěn)，在濃度為40%時，抑制效果最佳。熱風干燥在乙醇體積分數為40%、60%、80%時的提取液對α-淀粉酶的抑制率在64%～67%，互相之間無顯著性差異；冷凍干燥在40%、60%、80%時的提取液對α-淀粉酶的抑制率在61%～66%，互相之間無顯著性差異。桑葚中所含的降糖活性成分中包括槲皮素，據文獻報道，槲皮素幾乎不溶于水，其降糖效果較好，因此在桑葚醇提物中可能槲皮素起主要降糖作用[10-11]，40%的乙醇有利于槲皮素的溶出，因此濃度的提升不會使得降糖活性提高。對比表1的總黃酮、總酚、總花色苷的含量，冷凍干燥活性物質含量顯著高于熱風干燥活性物質含量，但在乙醇濃度相同的條件下，熱風干燥的降糖活性較冷凍干燥的降糖活性稍好(顯著性未在圖中標出，但通過SPSS分析，20%、40%乙醇體積分數的2種處理方式的桑葚提取液對α-淀粉酶的抑制率存在顯著性差異，60%、80%的乙醇濃度2種處理方式的桑葚提取液對α-淀粉酶的抑制率不存在顯著性差異，可能是由于熱風干燥的醇提物中除槲皮素外還有熱風干燥在加熱過程中產生的酚類物質。據報道[12]，非強熱的加熱過程可能會導致酚類物質的前體酚醛分子非酶轉化成酚類物質，加熱所生成的酚類物質可能具有較高的降糖活性，所以導致乙醇作為提取劑，熱風干燥的降糖活性要略高于冷凍干燥的降糖活性。

同乙醇體積分數無相同小寫字母表示2種干燥方式差異顯著(P<0.05)圖1 不同干燥方式的桑葚渣醇提液對α-淀粉酶的 活性的影響

2.3 對桑葚渣水提液活性成分含量的影響

選取熱風干燥、冷凍干燥后的桑葚粉，以水作為提取溶劑，探究在蒸餾水的提取下活性因子的含量，結果如表2。

表2 不同干燥方式的桑葚渣水提液中 活性成分含量

注：同列無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，2種干燥方式處理后的桑葚渣經水提取后，提取液中活性成分含量存在顯著差異。冷凍干燥后的桑葚渣水提液中的總黃酮、總酚和總花色苷含量顯著高于熱風干燥后桑葚渣水提液的含量，分別是熱風干燥桑葚水提液的1.76、1.49、3.60倍。這可能是由于冷凍干燥溫度低且含氧量少，可減少總黃酮、總酚和總花色苷的氧化，特別是易氧化的花色苷[9]。對比表1，桑葚水提液的活性成分含量低于桑葚醇提液中活性成分含量，這可能是由于黃酮、多酚、花色苷更易溶于醇，所以醇提液的活性物質含量要高于水提液的活性物質含量。

2.4 對桑葚渣水提液抑制α-淀粉酶活性的影響

由圖2可知，熱風干燥處理的桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率為70.3%，冷凍干燥處理的桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率為58.3%，兩者存在顯著性差異，但都顯著低于陽性對照阿卡波糖。冷凍干燥的桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率低于熱風干燥的桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率，可能是由于熱風干燥在加熱過程中生成了具有較高降糖活性的酚類物質[12]。據文獻報道[10-11]，花色苷也具有降糖的功效，但起主要降糖效果的物質可能為酚類物質，所以冷凍干燥的桑葚渣水提液中的花色苷雖然比熱風干燥的桑葚水提液花色苷高出很多，但降糖效果卻不及熱風干燥后的桑葚渣。

無相同小寫字母表示處理方式間差異顯著(P<0.05)圖2 不同處理方式的水提液對α-淀粉酶的 抑制效果

對比表1、圖1、表2、圖2發(fā)現，熱風干燥后桑葚渣水提液中的活性物質含量最低，但降糖活性略高于熱風干燥醇提液，可能是由于桑葚水提液和醇提液中具有降糖活性的物質不同。醇提有利于槲皮素的釋放，槲皮素具有良好的降糖效果，桑葚醇提液中可能是槲皮素起主要降糖作用[10]。而熱風干燥以及水提都能釋放酚類物質，酚類物質也可能與其他化學物質之間存在協同作用[11]，使得桑葚水提液的降糖活性與醇提液的降糖活性相當。而冷凍干燥的桑葚水提液中只有水提得到的具有較高的降糖活性的物質，因此冷凍干燥的桑葚水提液的降糖活性不及醇提液的降糖活性。綜上，熱風干燥的桑葚渣選擇水作為提取劑，冷凍干燥選擇體積分數為40%的乙醇作為提取劑。

3 小結

熱風干燥、冷凍干燥的桑葚活性物質的釋放規(guī)律都是在乙醇體積達到60%時，活性物質釋放最多，這種規(guī)律可能和處理方式關系不大，而與提取劑的極性相關。桑葚中具有降糖活性的物質分為水溶性和醇溶性2部分，且降糖活性相差不大，導致桑葚水提物和醇提物具有相當的α-淀粉酶抑制活性。雖然冷凍干燥后的桑葚渣中，活性成分含量均顯著高于熱風干燥后的桑葚渣，但α-淀粉酶抑制活性相差不大，表明熱風干燥過程中生成了少量的性質比較穩(wěn)定的活性成分，如酚類化合物。因此，在實際應用中可根據產品需求對桑葚渣采取合適的干燥處理和提取方式，提高桑葚渣的利用率。