雷美康，馮敬騫，徐思綺，彭芳，祝子銅，葉有標，徐佳文，韓超

(1.衢州出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，浙江 衢州 324003； 2.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 衢州 324000； 3.溫州出入境檢驗檢疫技術(shù)中心，浙江 溫州 325027)

胡柚(Citruschangshan-huyouY. B. Chang)為浙江特有的柚類資源，主要分布在常山、衢江、柯城、龍游、江山、開化等地，果實具有豐產(chǎn)、抗凍、適應(yīng)性強、特耐貯藏，及貯藏后品質(zhì)更佳的特性[1-3]。胡柚中有大量黃酮類、萜類化合物和酚酸等活性成分[2,4]，營養(yǎng)豐富，不僅是美味的食用水果，還具有很高的藥用價值。近年，常山胡柚片更是以“衢枳殼”名義列入《浙江省中藥炮制規(guī)范》[5]。作為功能食品基料和藥品原料，胡柚具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。

隨著對胡柚保健功能認識的逐步加強，人們對胡柚果皮和果肉中主要功能性成分的含量也越來越關(guān)注[6-10]，但關(guān)于胡柚不同部位中多種功能性成分含量的同時測定方法一直未見文獻報道。本實驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定胡柚中不同部位9種功能性成分的分析方法。該方法操作簡便，靈敏度高、結(jié)果準確，現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

胡柚樣品購自水果市場，經(jīng)溯源，均來自浙江省衢州市常山縣。

標準品：橙皮苷(CAS 520-26-3，純度97.06%)，新橙皮苷(CAS 13241-33-3，純度98.76%)，橙皮素(CAS 520-33-2，純度98.45%)，柚皮苷(CAS 10236-47-2，純度99.33%)，蕓香柚皮苷(CAS 14259-46-2，純度99.38%)，柚皮素(CAS 480-41-1，純度98.09%)，檸檬苦素(CAS 1180-71-8，純度99.08%)，諾米林(CAS 1063-77-0，純度99.32%)，圣草次苷(CAS 13463-28-0，純度98.16%)，均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，實驗用水為超純水。

Ultimate 3000超高效液相色譜-TSQ Vantage三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司；Multifuge X1R離心機，美國Thermo Scientific公司；高速粉碎機(200 g)，浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

精確稱取9種功能性成分的標準品10 mg(精確至0.1 mg)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，混勻，配制成1 mg·mL-1的單標儲備液。根據(jù)需要移取適量儲備液，用甲醇-水(體積比1∶1)稀釋成適宜濃度的標準工作溶液，避光保存于4 ℃冰箱中。如橙皮苷不易溶解，可加入適量的乙酸銨。

1.2.2 試樣制備

將采集的胡柚經(jīng)超純水清洗擦干后，分為果皮和果肉兩部分，分別取適量樣品攪碎、混勻，備用。

1.2.3 樣品前處理

稱取果皮0.5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料離心管中，準確加入10 mL甲醇-水(體積比6∶4)溶液，超聲提取5 min，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，提取2次，合并提取液過0.22 μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

稱取果肉2.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料離心管中，準確加入10 mL甲醇-水(體積比6∶4)溶液，超聲提取5 min，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Accucore XL C18柱(150 mm×4 mm，4.6 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；流速：0.5 mL·min-1。流動相：A為甲醇，B為0.15%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1.0 min，30%A、70%B；1.0～14.0 min，30%A～65%A、70%～35%B；14.0～14.1 min，65%A～95%A、35%～5%B；14.1～20.0 min，95%A、5%B；20.0～20.1 min，90%A～30%A、10%B～70%B；20.1～22.0 min，30%A、70%B。

1.2.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI)；掃描方式：正負離子切換掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：+3 500(-3 000)V；毛細管溫度(capilirry temperature)：270 ℃；干燥氣流量(gas flow)：10 L·min-1；噴霧氣壓力(Nebulizer)：45 psi(英制單位，儀器系統(tǒng)中使用，45 psi約合0.31 MPa)；鞘氣溫度(sheath gas temp)：350 ℃；鞘氣流速(sheath gas flow)：30 L·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取方法

胡柚中功能性成分的提取方法主要有索氏提取法和超聲輔助提取法2種。因超聲輔助提取法具有操作簡便、快速、提取效率高等優(yōu)點，所以本實驗選擇超聲輔助提取法提取胡柚中9種功能性成分。

2.1.2 提取液

比較不同體積比的甲醇-水溶液作為提取液對胡柚果肉和果皮中9種成分提取效率的影響，當(dāng)采用甲醇-水(體積比6∶4)作為提取液時，提取率接近100%，提取較為充分。

2.1.3 提取次數(shù)

比較不同提取次數(shù)對胡柚果肉和果皮中9種成分提取效率的影響，果皮一次提取后提取率為75%～90%，2次提取后，提取率接近100%，而果肉經(jīng)1次提取后，提取率即達到94%以上。據(jù)此認為，果肉提取1次即可，而果皮須提取2次。

2.2 色譜條件優(yōu)化

考查甲醇-水(A)、乙腈-水(B)、甲醇-0.15%甲酸溶液(C)、乙腈-0.15%甲酸溶液(D)等4組流動相體系對圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、檸檬苦素、柚皮素、橙皮素、諾米林等9種目標分析物的分離效果和峰信號強度。結(jié)果表明，9種目標分析物在甲醇-0.15%甲酸水溶液體系下各色譜峰分離效果和峰信號響應(yīng)值最佳，故選擇甲醇-0.15%甲酸溶液作為分離9種化合物的流動相。由此得到9種功能性成分的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(圖1)。

1，圣草次苷；2，蕓香柚皮苷；3，柚皮苷；4，橙皮苷；5，新橙皮苷；6，柚皮素；7，檸檬苦素；8，橙皮素；9，諾米林圖1 功能性成分的多反應(yīng)監(jiān)測色譜

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取標準品溶液采用流動注射法直接進樣，分別在電噴霧電離源的正離子和負離子模式下進行掃描。確定各化合物的母離子，分別優(yōu)化質(zhì)譜的S-Lens電壓、碰撞能量等參數(shù)，進行子離子掃描，選取2種豐度強、穩(wěn)定的碎片離子作為定量與定性離子。

蕓香柚皮苷與柚皮苷為同分異構(gòu)體，實驗表明，蕓香柚皮苷的[M+H]+離子信號強度大于[M-H]-，而柚皮苷的[M+H]+離子信號強度弱于[M-H]-。橙皮苷與新橙皮苷互為同分異構(gòu)體，實驗表明，橙皮苷的[M+H]+離子信號強度大于[M-H]-，而新橙皮苷的[M+H]+離子信號強度弱于[M-H]-。

實驗發(fā)現(xiàn)，毛細管溫度對諾米林的離子加合物形態(tài)有較大的影響。當(dāng)毛細管溫度在270 ℃左右時，諾米林的[M+H]+準離子峰信號最強。

優(yōu)化后的保留時間、質(zhì)荷比、碰撞能量、S-Lens電壓和掃描模式詳見表1。

表1 各功能性成分的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

注：標*的為定量離子。

2.4 方法的線性范圍和定量限

配制一系列不同濃度的混合標準工作溶液，依次進樣，分別以9種功能性成分的峰面積為縱坐標(y)，以相應(yīng)的進樣濃度為橫坐標(x)，做標準曲線。結(jié)果表明，9種功能性成分在0.01～5 μg·mL-1，濃度與峰面積線性良好。以實際檢測時的信噪比大于10確定定量限。9種功能性成分的標準曲線、決定系數(shù)、線性范圍、定量限見表2。

表2 各功能性成分檢測的線性范圍、檢出限及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

分別以果皮和果肉中9種功能性成分本底值的50%、100%和200%水平進行加標回收實驗，每個水平重復(fù)測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差，結(jié)果如表3所示，均符合檢測要求。

2.6 各功能性成分含量的檢測結(jié)果

取2個樣品，分別分為果肉和果皮2部分，按前述方法測定各功能性成分的含量，每個樣品重復(fù)2次，取平均值，結(jié)果見表4。說明本方法可以同時測定胡柚中9種功能性成分的含量。

3 小結(jié)

本實驗建立起一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測胡柚中9種功能性成分的分析方法。具體地：將胡柚樣品分為果皮和果肉2部分，果皮經(jīng)甲醇-水(體積比6∶4)超聲波提取2次(每次5 min)、果肉經(jīng)甲醇-水(體積比6∶4)超聲波提取1次(5 min)后，采用Accucore XL C18柱(150 mm×4 mm，4.6 μm)分離，以甲醇-0.15%甲酸溶液為流動相梯度洗脫，在電噴霧離子源正負離子切換多反應(yīng)監(jiān)測模式串聯(lián)質(zhì)譜下檢測，外標法定量。本文方法對胡柚中9種功能性成分進行同時檢測時，樣品濃度與峰面積線性良好，決定系數(shù)大于0.997，加標回收率在83.6～116.2%，相對標準偏差在1.58～8.33%(n=6)。該方法快速、靈敏、準確，適用于胡柚中9種功能性成分的同時定性和定量檢測。

表3 各功能性成分檢測的加標回收率和相對標準偏差

表4 胡柚(果皮和果肉)中9種功能性成分的含量檢測結(jié)果 mg·kg-1