劉元，文春南，劉淼，李文，洪利亞，麻兵繼

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 中藥材系，河南 鄭州 450002)

山藥(DioscoreaoppositaThunb)為薯蕷科多年生草質(zhì)藤本植物薯蕷的根莖[1]。懷山藥是指在古懷慶府地區(qū)(主要位于今河南焦作境內(nèi))種植的山藥，因其口味和療效俱佳，位列“四大懷藥”之一，是河南省著名道地藥材。研究表明，懷山藥含皂苷、黏液質(zhì)、尿囊素、膽堿、山藥堿、淀粉、糖蛋白、多酚氧化酶、VC、氨基酸等成分，還含有硒、鐵、銅、鋅、錳、鈣等多種微量元素[2]。懷山藥有健脾、補(bǔ)肺、固腎、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫機(jī)能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、心肺功能和神經(jīng)系統(tǒng)等功能[3]，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用大宗藥材之一。與懷山藥相對(duì)的是市場上銷售的菜山藥，菜山藥多種植于山東、山西和陜西等地區(qū)，雖同為山藥，但兩者外形上區(qū)別很大。懷山藥直徑一般為1.0～1.5 cm，但菜山藥則非常的粗壯，直徑能達(dá)到4～5 cm，且形狀不規(guī)則。一般認(rèn)為，懷山藥的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值要遠(yuǎn)高于菜山藥[4]，但關(guān)于懷山藥道地品質(zhì)的形成機(jī)制尚不明確。

植物內(nèi)生菌是指那些在生活史的部分或全部階段都生活在植物組織活細(xì)胞間隙而對(duì)植物沒有明顯傷害的一類微生物。近年來，隨著國內(nèi)外內(nèi)生菌研究熱度的不斷提升，中藥道地藥材內(nèi)生菌的研究已成為一大熱點(diǎn)。研究表明，藥用植物內(nèi)生菌不僅自身能獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而且還能參與宿主的代謝過程，對(duì)有效成分的產(chǎn)生和積累起到很大的促進(jìn)作用[5]。王曉龍等[6]從懷山藥的根中共分離得到41株內(nèi)生菌，其中18株細(xì)菌，經(jīng)鑒定為8個(gè)屬；另有23株真菌，經(jīng)鑒定為6個(gè)屬[7]。張建新等[8]從懷山藥中分離得到32株內(nèi)生菌，其中11株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)白菜軟腐菌具有拮抗性。趙龍飛[9]從懷山藥中分離得到34株內(nèi)生菌，其中7株具有明顯的抑菌作用。另外，常江川[10]從懷山藥中分離得到65株金黃色葡萄球菌、32株大腸埃希菌。

高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing，HTS)是近年來廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)分析方法之一，該測序技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本的特點(diǎn)，可以深入、細(xì)致地研究微生物群落結(jié)構(gòu)，從而克服由于傳統(tǒng)菌株分離培養(yǎng)的限制而導(dǎo)致很難獲得宿主植物完整內(nèi)生菌譜的技術(shù)障礙，近年來已應(yīng)用于多個(gè)中藥材道地性的研究[11]。本實(shí)驗(yàn)采用Illumina二代高通量測序技術(shù)分別對(duì)懷山藥和菜山藥根莖中的內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測序，進(jìn)而對(duì)基因序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類。在此基礎(chǔ)上分別對(duì)懷山藥和菜山藥內(nèi)生細(xì)菌的群落組成進(jìn)行分析，分析和比較兩者群落內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)和群落間的差異。在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平分析比較了懷山藥和菜山藥根莖中的內(nèi)生細(xì)菌的群落組成，并從ChaoⅠ、Simpson和Shannon等生態(tài)指數(shù)和Rank-Abundance曲線方面分析對(duì)比了2種來源的山藥內(nèi)生細(xì)菌群落內(nèi)的物種豐富度和均度，為進(jìn)一步研究懷山藥的品質(zhì)形成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

懷山藥樣本系2016年10月采集于河南省焦作市溫縣懷山藥道地產(chǎn)區(qū)，選擇10株外觀健康的山藥植株，取其根莖，放入無菌樣品袋中，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系麻兵繼教授鑒定為鐵棍山藥。菜山藥系鄭州市超市購買。選擇2根外觀正常的菜山藥，放入無菌樣品袋中，2組樣品均放在4 ℃環(huán)境中保存，于12 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理，樣品分別命名為Huai和Cai。

1.2 樣品表面消毒

將懷山藥根莖和菜山藥根莖表面用蒸餾水清洗干凈，然后用濾紙吸干表面水分。將2組樣品放入無菌操作臺(tái)中，紫外照射40 min，每隔10 min將樣品翻轉(zhuǎn)一次，再用75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分。第5次沖洗的無菌水用移液槍吸取200 μL，用涂布器在PDA培養(yǎng)基上涂布，作為空白對(duì)照(CK)組，每個(gè)樣本空白組重復(fù)3次，觀察各個(gè)樣品CK組有無菌落產(chǎn)生，作為評(píng)判樣本表面是否消毒徹底的指標(biāo)[12]。

1.3 樣本DNA提取與純化

使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.4 16S rDNA V4區(qū)域的PCR擴(kuò)增

將提取的DNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋作為模板，把合成的帶有Barcode的特異引物對(duì)樣本的16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR采用高保真、高效率和高速PCR酶(TOYOBO公司的KOD-Plus-Neo DNA Polymerase)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段，使用2%瓊脂糖電泳檢測，檢測條件為5 V·cm-1，20 min。然后將切膠回收的PCR產(chǎn)物送北京艾普希隆生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA V4基因的測序分析(使用Illumina公司的MiSeq Reagent Kit v2測序試劑盒)。

1.5 生物信息學(xué)分析

測序得到的PE reads首先利用FLASH3進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列后，在97%的相似性水平上使用UPARSE算法7進(jìn)行OTU的聚類，在使用Uchime 8去除嵌合體后，挑選出OTU的代表性序列。使用Greengene 10進(jìn)行物種分類信息的劃分，同時(shí)去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細(xì)菌或古菌界的OTU，并使用 FastTree12構(gòu)建進(jìn)化樹。去除在進(jìn)化樹構(gòu)建過程中被過濾掉的OTU，然后再使每個(gè)樣品的OTU具有相同的序列數(shù)?；谏鲜鯫TU的結(jié)果在群落組成(compositional)水平和系統(tǒng)發(fā)育(phylogenetic)水平上使用QIIME、Mothur和R等軟件對(duì)樣本進(jìn)行群落內(nèi)多樣性分析和群落間結(jié)構(gòu)差異的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本OTU代表序列聚類分析

采用classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類學(xué)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。圖1～3分別表現(xiàn)了懷山藥和菜山藥內(nèi)生細(xì)菌在門(phylum)、綱(class)和屬(genus)水平的群落結(jié)構(gòu)和分類比較結(jié)果。從門水平來看，懷山藥和菜山藥的內(nèi)生細(xì)菌兩者均主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變性菌門(Proteobacteria)，兩者都存在有少量的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠菌門(Chlorobi)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和浮霉菌門(Planctomycetes)。值得注意的是，懷山藥的內(nèi)生細(xì)菌要比菜山藥豐富，放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和裝甲菌門(Armatimonadetes)為懷山藥的特有真菌門。從綱水平來看，兩者內(nèi)生細(xì)菌都主要分布在梭菌綱(Clostridia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)，但懷山藥的細(xì)菌群落組成比菜山藥的細(xì)菌群落組成更加豐富，其中酸微菌綱(Acidimicrobiia)、疣微菌綱(Spartobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為懷山藥特有菌綱。從屬水平來看，懷山藥內(nèi)生細(xì)菌主要分布在狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto1)、類似牙球菌屬(Blastocatella)，而菜山藥內(nèi)生細(xì)菌則主要在Clostridiumsensustricto1這一屬水平，但在類似牙球菌屬中分布較少。另外，兩者在桿菌屬(Leadbetterella)、木洞菌屬(Woodsholea)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、土微菌屬(Pedomicrobium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等都有少量分布。因此，懷山藥內(nèi)生細(xì)菌在多個(gè)層面上豐富度均大于菜山藥。

圖1 門水平上2種山藥內(nèi)生細(xì)菌的分布

圖2 綱水平上2種山藥內(nèi)生細(xì)菌的分布

圖3 屬水平上2種山藥內(nèi)生細(xì)菌的比較

圖4 門水平上2種山藥內(nèi)生細(xì)菌熱度圖分析

2.2 樣本Heatmap熱度圖分析

Heatmap用于表示一個(gè)或多個(gè)組的樣品在某一分類水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來表征，顏色越偏紅，說明豐度越高，越偏藍(lán)色說明豐度越低，群落內(nèi)既可根據(jù)豐度和組成進(jìn)行聚類，也可按照特定的順序進(jìn)行橫縱坐標(biāo)的排列。從圖4可知，在門水平上，在懷山藥內(nèi)生細(xì)菌主要分布的擬桿菌門(Bacteroidetes)在群落中的比例為31.8%，厚壁菌門(Firmicutes)為24.8%，變性菌門(Proteobacteria)為18.6%。菜山藥內(nèi)生細(xì)菌中主要分布為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)分別為38.3%、24.5%。從圖4中可以看出懷山藥群落組成要比菜山藥復(fù)雜，且放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、裝甲菌門(Armatimonadetes)為懷山藥特有菌門。從圖5可以看出，懷山藥內(nèi)生細(xì)菌在屬水平上分別為Bacteroldetes(uncultured)、Proteobacteria(uncultured)、Gemmatimonadetes(uncultured)、Chlorobi(uncultured)、Acidobacteria(uncultured)、Chloroflexi(uncultured)、Firmicutes(uncultured)、Actinobacteria(uncultured)、Lentisphaerae(uncultured)、Armatimonadetes(uncultured)和Planctomycetes(uncultured)，而菜山藥分布最多的為Bacteroidetes(uncultured)屬。

圖5 屬水平上2種山藥內(nèi)生細(xì)菌熱度圖分析

2.3 樣本進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析能夠揭示出生物進(jìn)化關(guān)系的順序，進(jìn)而可分析進(jìn)化歷史及其相應(yīng)的一些機(jī)制。系統(tǒng)發(fā)育分析的基礎(chǔ)是進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，即通過選取某一類基因序列(此樣本選取的基因序列是16S rDNA V4區(qū)域)進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)序列間的堿基差異和序列特點(diǎn)選取合適的進(jìn)化模型和構(gòu)建方法來構(gòu)建種水平進(jìn)化樹。我們選取豐度最高的50個(gè)OTU與NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列進(jìn)行比對(duì)，采用最大似然法構(gòu)建發(fā)育樹(圖6)。從圖6可知，狹義梭菌Clostridiumsensustricto1在懷山藥和菜山藥分布均最多，豐度分別為75、130。懷山藥的特有菌有鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、Planctomycessp.、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.和假單胞菌(Pseudomonassp.)，而菜山藥中的特有菌為Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.，在兩者中OTU豐度都很小，與上述分類分析的結(jié)果相吻合。

圖6 懷山藥和菜山藥內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹比較

2.4 樣本alpha多樣性分析

在群落生態(tài)學(xué)的研究中，物種多樣性包括了alpha-多樣性(群落內(nèi))、beta-多樣性(群落間)和gamma-多樣性(區(qū)域總多樣性)。通過樣本的alpha-多樣性分析可以反映微生物群落的物種豐度(Richness)和均勻性(Evenness)。alpha多樣性分析的分析指數(shù)有ChaoⅠ(估算物種豐富度)、Shannon(估算樣本中微生物多樣性)和Faith’s PD(估算物種豐富度)。分析指數(shù)結(jié)果如圖7所示。綜合三項(xiàng)指數(shù)分析可知，懷山藥內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性要高于菜山藥。

Observed代表觀測到的OTU數(shù)目，可用來和其他多樣性指標(biāo)進(jìn)行比較圖7 2種山藥內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性比較

Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的2個(gè)方面，即物種多度和物種均勻度。構(gòu)建方法是統(tǒng)計(jì)單一樣本中的每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTU按豐度由大到小等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以累積的序列豐度為縱坐標(biāo)做圖。在水平方向，物種的多度由曲線的寬度來反映，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐富度越高；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。由圖8可知，懷山藥的內(nèi)生細(xì)菌要比菜山藥豐富，種群分布更加均勻，由于兩者的曲線都有較大斜率的變化，故兩者中都分布有優(yōu)勢(shì)菌群。

圖8 2種山藥內(nèi)生細(xì)菌Rank-Abundance曲線比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次利用高通量測序技術(shù)對(duì)懷山藥和菜山藥根莖內(nèi)環(huán)境中的細(xì)菌群落進(jìn)行對(duì)比分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，懷山藥根莖內(nèi)生菌的物種豐富度要高于菜山藥，且懷山藥內(nèi)生菌分布更加均勻。在綱水平上懷山藥根莖中分布最多的為擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌，所占比例為31.8%，其次為厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌，所占比例為24.8%；而在菜山藥根莖中分布最多的為厚壁菌門(Firmicutes，38.3%)，其次為擬桿菌門(Bacteroidetes，24.5%)。懷山藥根莖中的特有菌門為Actinobacteria(2%)、Verrucomicrobia(0.6%)和Armatimonadetes(0.3%)。在屬水平上，兩者中分布最多的均為Clostridiumsensustricto1菌屬，在懷山藥和菜山藥中都存在Blastocatella、Leadbetterella、Woodsholea木洞菌屬、Acinetobacter不動(dòng)桿菌屬、Pedomicrobium土微菌屬、Pseudomonas等7種菌屬細(xì)菌。經(jīng)比較分析確定革蘭氏陰性棒狀桿菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、浮霉?fàn)罹?Planctomycessp.)、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.、假單胞菌(Pseudomonassp.)為懷山藥的特有菌，而菜山藥中的特有菌為Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.。本文首次比較系統(tǒng)地對(duì)懷山藥和菜山藥內(nèi)生細(xì)菌的分布情況進(jìn)行對(duì)比分析，為懷山藥道地性研究提供了一定的基礎(chǔ)。