宋鵬書， 潘火珍， 廖 明, 2△

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1生命科學(xué)研究院, 2區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530021)

肝纖維化是慢性肝損傷中組織修復(fù)過程的代償性反應(yīng)，其最終結(jié)果是肝硬化甚至肝癌，在全球有很高的發(fā)病率和死亡率[1]。肝纖維化的主要病理特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝組織內(nèi)的過度合成和異常沉積，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)分化為成纖維母細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)[2]。因此，抑制HSCs的增殖，促進(jìn)HSCs死亡成為抗肝纖維化治療的核心問題。

自噬是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，是通過溶酶體吞噬自身胞質(zhì)或細(xì)胞器達(dá)到細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和能量再利用的過程。自噬在治療肝纖維化方面是一把雙刃劍，研究發(fā)現(xiàn)自噬既具有抗肝纖維化的作用同時也會促進(jìn)肝纖維化的形成[3]。如對于脂肪性肝纖維化早期，自噬能促進(jìn)脂滴的代謝，有抑制肝纖維化的作用；對于HBV和HCV 引起的肝纖維化，HBV和HCV 能夠利用自噬增強(qiáng)復(fù)制，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[4]。

有研究表明HSCs活化與自噬有關(guān)，抑制HSCs自噬可以減輕肝纖維化[5]。Nazim等[6]發(fā)現(xiàn)三羥基異黃酮(genistein)可通過抑制自噬通量增強(qiáng)TRAIL-誘導(dǎo)的A549腺癌細(xì)胞死亡;Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)?；撬?taurine)通過抑制ARPE-19細(xì)胞自噬對其存活具有保護(hù)作用；Li等[8]發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)預(yù)處理可抑制伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝炎中的肝細(xì)胞凋亡和自噬。我們研究發(fā)現(xiàn)taurine、EGCG和genistein聯(lián)合用藥能明顯抑制HSCs的增殖并促進(jìn)HSCs的凋亡[9-11]，并且比單一用藥具有更顯著的抗肝纖維化的作用。但聯(lián)合用藥是否通過抑制細(xì)胞自噬達(dá)到抗肝纖維化的作用尚未明確。為此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合以上3種藥物處理活化的HSCs，觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體和相關(guān)生物學(xué)變化，探討聯(lián)合用藥抗肝纖維化作用與自噬的關(guān)系，以期為聯(lián)合用藥應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)，并為肝纖維化的治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞與試劑 HSC-T6細(xì)胞為活化的HSCs, 具有纖維化特性，由廣西醫(yī)科大學(xué)姜海行教授饋贈。?；撬?批號Q/C5411196-9)購自成都科龍化工試劑廠；EGCG(批號 TP1110001P)購自四川樂山禹伽茶業(yè)科技開發(fā)有限公司；三羥基異黃酮(批號 M11111601)、吖啶橙(acridine orange，AO)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1, Baf-A1)和二甲基亞砜購自Sigma；胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；兔抗鼠LC3和beclin-1單抗隆抗體購自CST；兔抗鼠GAPDH多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體及BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗兔熒光 II 抗購自LI-COR；CCK-8試劑盒購自MedChem Express。

1.2儀器 蛋白電泳儀和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LICOR)；全自動熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)(EVOS FL auto)；透射電子顯微鏡(Hitachi)。

2 方法

2.1HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換 1 次培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%左右，使用含有EDTA的0.25%的胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組：即對照(control)組(完全培養(yǎng)基)、聯(lián)合藥物(taurine+EGCG+genistein,TEG)組(256 mg/L taurine、 45 mg/L EGCG和10 mg/L genistein)、Baf-A1組(0.5 μmol/L Baf-A1)和TEG+Baf-A1組(濃度同上)。

2.2CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 胰酶消化HSCs，制成密度為5×107/L的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，各組4×6孔。四周一圈孔內(nèi)加入100 μL PBS，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；接種24 h細(xì)胞貼壁后，取出96孔培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)基，各組分別加入100 μL相應(yīng)濃度的TEG、Baf-A1和TEG+Baf-A1，細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，把96孔培養(yǎng)板中各組液體全部吸出，將CCK-8試劑與完全培養(yǎng)基按體積比1∶9配置成反應(yīng)液，混勻后加入孔內(nèi)，另取6個未接種細(xì)胞的孔，也加入100 μL反應(yīng)液，作為空白對照，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；孵育1～2 h后，取出96孔培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。每次實(shí)驗(yàn)均采用不同樣本重復(fù)3 次。

2.3透射電子顯微鏡觀察自噬體 胰酶消化細(xì)胞，低速離心收集細(xì)胞，經(jīng)緩沖液沖洗后向細(xì)胞沉淀中加入3%戊二醛緩沖固定液固定2 h，緩沖液沖洗，向樣品中加入2%四氧化鋨緩沖固定液進(jìn)行后固定；用梯度乙醇對樣品進(jìn)行梯度脫水；丙酮置換樣品中乙醇，然后進(jìn)行環(huán)氧樹脂滲透，包埋，聚合，切片，染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬體變化。

2.4吖啶橙染色觀察自噬溶酶體 胰酶消化收集HSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×108/L。取6孔板每孔分別加入蓋玻片后，取4個孔分別加入2 mL細(xì)胞懸液。24 h后，吸出培養(yǎng)基,各組分別加入2 ml TEG、Baf-A1和TEG+Baf-A1，細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次。用95%乙醇固定15～30 min, 再用1%醋酸作用30 s; 馬上加入0.2 g/L吖啶橙染色30～60 s；繼續(xù)加入0.1 mol/L CaCl2處理2 min, 再用PBS漂洗3次；最后用甘油封片在倒置熒光顯微鏡下觀察HSCs內(nèi)部自噬溶酶體的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5Western blot檢測LC3-II和beclin-1的表達(dá) 將HSCs分4組接種在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h至貼壁,更換培養(yǎng)基加入TEG、Baf-A1、TEG+Baf-A1和完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取和測定。棄掉培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗滌HSCs后按照博士德蛋白抽提試劑盒說明書，每個培養(yǎng)皿加入20 μL RIPA 和0.02 μL PMSF，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，冰上放置30 min，4 ℃、12 000×g，離心20 min，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA 法測定蛋白含量。熱變性后，取40 μg 總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，恒流120 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h。室溫下5%脫脂奶粉勻速搖晃封閉1 h后，加入I抗[兔抗LC3A/B(濃度稀釋1∶500)、兔抗beclin-1(濃度稀釋1∶500)、兔抗β-actin(濃度稀釋1∶500)和兔抗GAPDH(濃度稀釋1∶300)]，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后用對應(yīng)種屬的熒光 II 抗室溫下孵育2 h。以目的蛋白和內(nèi)參照的比值反映目的蛋白相對表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)均采用不同樣本重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測定結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法檢測HSCs存活率的變化

給藥24 h之后，TEG和Baf-A1對肝星狀細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用。與對照組相比，TEG組和Baf-A1組細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05);與TEG組相比，TEG+Baf-A1組細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低(P<0.01),結(jié)果表明聯(lián)合藥物和自噬抑制劑都會抑制HSCs的細(xì)胞活力，見圖1。

2 透射電鏡觀察HSCs內(nèi)的自噬情況

通過透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)HSCs中有雙層膜的自噬體和單層膜結(jié)構(gòu)自噬溶酶體，其中包裹變性壞死的細(xì)胞器和部分蛋白質(zhì)，TEG組HSCs中的自噬溶酶體已經(jīng)壞死，細(xì)胞自噬無法正常運(yùn)行，說明TEG對細(xì)胞自噬具有抑制作用，見圖2。

Figure 1.The viability of HSCs treated with TEG, Baf-A1, and TEG+Baf-A1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTEG group.

圖1聯(lián)合藥物與自噬抑制劑對HSCs活力的影響

Figure 2.Transmission electron microscopy showed autophagosomes and autophagolysosomes in HSCs.

圖2透射電鏡觀察各組HSCs內(nèi)自噬體與自噬溶酶體的變化

3 吖啶橙染色觀察TEG和Baf-A1分別作用HSCs后自噬溶酶體的變化

吖啶橙結(jié)合雙鏈DNA時細(xì)胞核顯示綠色熒光，而在低pH條件下與自噬溶酶體反應(yīng)時發(fā)出紅色熒光[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照組中紅色熒光區(qū)域格外明顯，細(xì)胞形態(tài)完好，TEG組和Baf-A1組只有微弱的紅色熒光，同時細(xì)胞暗淡，出現(xiàn)皺縮、變圓等不正常形態(tài)，見圖3。

Figure 3.Effects of TEG and Baf-A1 on the autophagy of HSCs detected by fluorescence microscopy after acridine orange staining (scale bar=100 μm).

圖3吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察HSCs自噬

4 Western blot檢測TEG對HSCs中LC3-II和beclin-1表達(dá)的影響

TEG作用HSCs 24 h后，與對照組相比，TEG組中LC3-II的表達(dá)量顯著降低；Baf-A1組中LC3-II的表達(dá)量卻顯著高于TEG+Baf-A1組; TEG+Baf-A1組LC3-II的表達(dá)量介于TEG組和Baf-A1組之間，推斷TEG會抑制HSCs中自噬體合成。見圖4。

Figure 4.The protein levels of LC3-II in the HSCs treated with TEG, Baf-A1, and TEG+Baf-A1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTEG group.

圖4TEG對肝星狀細(xì)胞的LC3-II蛋白水平的影響

Western blot 法檢測beclin-1結(jié)果顯示, 與對照組相比，TEG組中beclin-1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，說明TEG抑制HSCs中自噬體合成。見圖5。

Figure 5.The protein levels of beclin-1 in the HSCs treated with TEG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5TEG對肝星狀細(xì)胞的beclin-1蛋白水平的影響

討 論

HSCs是肝纖維化的主要參與者，靜止的HSCs被激活之后，導(dǎo)致以膠原為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積且降解相對不足, 在肝內(nèi)過度沉積而引起肝纖維化[13]。HSCs活化與自噬有關(guān)，自噬有助于成纖維細(xì)胞內(nèi)脂類的分解代謝來維持能量平衡同時更新某些細(xì)胞器[14]，所以阻斷自噬會抑制HSCs增殖，減輕肝纖維化。Denardin等[15]報道紫色扁櫻桃提取物的抗肝纖維化作用可通過抑制的細(xì)胞自噬發(fā)生，從而引起活化的肝星狀細(xì)胞死亡。

TEG中的3種藥物均屬于天然藥物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)無論是單獨(dú)還是聯(lián)合使用的細(xì)胞毒性較低[16]。Taurine是人體內(nèi)一種氨基酸，在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，如氧化應(yīng)激、糖脂代謝、滲透壓調(diào)節(jié)、抗炎和解毒等；EGCG是綠茶中的一種主要的多酚類物質(zhì)，具有抗炎癥和抗纖維化的作用；genistein是一種異黃酮類化合物，是酪氨酸蛋白激酶的抑制劑，酪氨酸蛋白激酶信號途徑在肝星狀細(xì)胞的增殖、激活過程中起重要作用；另有研究表明taurine、EGCG和genistein具有抑制細(xì)胞自噬作用[6-8]。

本課題組前期的研究表明,TEG能明顯抑制HSCs的增殖并促進(jìn)HSCs的凋亡[9-11]，并且比單一用藥更有顯著的抗肝纖維化作用[17]，但TEG抗肝纖維化作用的機(jī)理仍未明確。本實(shí)驗(yàn)用CCK-8法檢測細(xì)胞活力的變化，結(jié)果顯示TEG與自噬抑制劑Baf-A1均能抑制肝星狀細(xì)胞的活力。為了研究TEG是如何通過阻礙細(xì)胞自噬間接抑制肝星狀細(xì)胞活力，采用透射電鏡和AO染色觀察HSCs內(nèi)部自噬變化，2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時顯示，對照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯自噬現(xiàn)象，經(jīng)過TEG處理之后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬溶酶體壞死且數(shù)量減少，說明細(xì)胞自噬進(jìn)程受到阻礙，即從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)可知TEG能阻斷活化的HSCs自噬。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對TEG影響下HSCs自噬相關(guān)蛋白LC3-II和beclin-1進(jìn)行分析，以探討TEG抗肝纖維化與自噬的關(guān)系。LC3是廣泛用于監(jiān)測自噬的標(biāo)志物，LC3存在2種轉(zhuǎn)化形式分別為LC3-I和LC3-II，其中LC3-II附著在自噬體膜上，所以LC3-II的表達(dá)量與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TEG處理細(xì)胞24 h之后，LC3-II的表達(dá)量顯著降低，說明自噬體在TEG的影響下數(shù)量減少，即TEG會抑制自噬體的合成；同時LC3-II的量不能完全體現(xiàn)自噬體的數(shù)量，因?yàn)榧?xì)胞自噬是一個連續(xù)的過程，自噬體生成之后需結(jié)合溶酶體生成自噬溶酶體，自噬體數(shù)量會相應(yīng)減少。Baf-A1為自噬抑制劑，其機(jī)理為抑制自噬體與溶酶體融合，從而造成自噬體的堆積。因此，Baf-A1作用細(xì)胞后，LC3-II的量代表的是合成的自噬體和自噬溶酶體總量[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TEG+Baf-A1組LC3-II的表達(dá)量小于Baf-A1組，說明Baf-A1引起的自噬體堆積變小，其原因是TEG減少了自噬體的合成。Beclin-1也是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白，它參與自噬體的形成[19]，本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果顯示TEG處理細(xì)胞24 h之后，與對照組相比TEG組中beclin-1的表達(dá)量顯著降低，說明TEG會降低自噬體的形成。