陳巧杰， 武少坤， 鄔耀軍， 陳 良， 沈萍萍

(1寧波市第二醫(yī)院骨科， 浙江 寧波 315010； 2寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院消化內(nèi)科， 浙江 寧波 315040)

跟腱炎是指跟腱急、慢性勞損引起的一種無(wú)菌性炎癥，常見(jiàn)于運(yùn)動(dòng)員和中老年患者[1-2]，其臨床癥狀以足跟部疼痛、僵硬，運(yùn)動(dòng)后疼痛加劇為主，不及時(shí)治療容易引發(fā)肌腱撕裂和斷裂[3]。目前，其臨床治療方法主要包括物理療法(如超聲波療法[4]、富血小板血漿療法[5]、體外沖擊波療法[6]、低水平激光療法[7]、冷凍療法[8]等)、通過(guò)手術(shù)切除跟腱周?chē)难装Y組織、非類(lèi)固醇抗炎藥的內(nèi)服外敷等[9]。但上述治療周期相對(duì)較長(zhǎng)，常常久治不愈，這在很大程度上與病變部位血液供應(yīng)不足以及細(xì)胞代謝失常有關(guān)，嚴(yán)重地影響了患者的日常生活[10]。

近年來(lái)，骨科專(zhuān)家正致力于尋找一種能促進(jìn)受損跟腱再生的方法來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)療法以便更好地醫(yī)治跟腱炎。干細(xì)胞作為一種具有多種分化潛能的原始細(xì)胞，可在一定程度上改善受損肌腱和韌帶的再生功能。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)來(lái)源于白色脂肪細(xì)胞，具有分化成肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及心肌細(xì)胞的能力[11]。脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)能釋放出細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子從而調(diào)控受損組織的重建[12]。此外脂肪干細(xì)胞還具有抗炎、促進(jìn)血管再生及有助于纖維母細(xì)胞增殖的作用[13]。近年來(lái)不少研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)可參與調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞的增殖和分化，如miR-34a在體內(nèi)外高表達(dá)可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化[14]；而Park等[15]的研究則表明miR-34a能抑制脂肪干細(xì)胞的增殖。目前脂肪干細(xì)胞越來(lái)越多被移植治療臨床疾病，如相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植治療慢性腎病和慢性阻塞性肺病等[16-17]。脂肪干細(xì)胞也具有分化為肌腱細(xì)胞的潛能[18]，如果將脂肪干細(xì)胞注射到跟腱部位，是否能分化為肌腱細(xì)胞，起到治療跟腱炎作用，目前鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本研究旨在探討miR-34a在脂肪干細(xì)胞移植治療跟腱炎的過(guò)程中是否發(fā)揮作用及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

雌性健康SD大鼠，12周齡，體重230～270 g，購(gòu)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(蘇)2017-0007。TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；RIPA裂解液和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Ⅰ型細(xì)菌膠原酶購(gòu)自Sigma-Aldrich；材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自日本計(jì)測(cè)系統(tǒng)公司；兔抗大鼠多克?、裥湍z原(collagenⅠ)、Scleraxis (Scx)、生腱蛋白C(tenascin C,TNC)和β-actin抗體購(gòu)自Abcam；SYBR? Premix Ex TaqTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；ECL 試劑盒和PVDF 膜購(gòu)自Millipore。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems。

2 方法

2.1人源脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 在無(wú)菌操作臺(tái)上，取抽脂手術(shù)患者皮下脂肪組織約2 g，剝除血管及結(jié)締組織后，眼科剪充分剪碎后，用PBS反復(fù)漂洗，除去紅細(xì)胞。加入含0.075% Ⅰ型膠原酶的PBS溶液，37 ℃消化1 h，再加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 800 r/min離心10 min，棄去上、中兩層，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、2 mmol/L谷氨酸和0.2 mmol/L抗壞血酸的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；颊咭押炇鹬橥鈺?shū)，所有實(shí)驗(yàn)也獲得了寧波市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的hADSCs接種到 6 孔板中，培養(yǎng)18 h左右待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，方可用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。用無(wú)RNA 酶槍頭吸取適量miR-34a 模擬物(miR-34a mimic)和抑制物(miR-34a inhibitor)(均由GenePharma提供)，分別與Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑混合于培養(yǎng)基中，室溫下靜置20 min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，前后輕搖細(xì)胞板使溶液混合均勻，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，棄去原培養(yǎng)基培基，更換為 2 mL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(pre-NC)和陰性對(duì)照(negative control,NC)組。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液接種于 96 孔板中，每孔100 μL (每孔1 000個(gè)細(xì)胞)，每組各設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每孔沿孔壁加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2孵育1 h后，用自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，測(cè)定轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)細(xì)胞的活力。

2.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康雌性SD大鼠30只隨機(jī)分為5組，每組6只，即PBS注射對(duì)照組(PBS組)、hADSCs治療組(hADSCs組)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的hADSCs治療組(hADSCs+NC組)、轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的hADSCs治療組(hADSCs+miR-34a組)及轉(zhuǎn)染anti-sense miR-34a的hADSCs治療組(hADSCs+anti-miR-34a組)。

2.5慢病毒載體的構(gòu)建 含miR-34a-mimics、 anti-miR-34a及NC的慢病毒質(zhì)粒載體由GenePharma合成并包裝。將hADSCs懸液以每孔5×104接種于96孔板中，計(jì)算感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，當(dāng)MOI達(dá)到50時(shí)，將10 μL預(yù)先配好滴度的慢病毒加入到各孔中，24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基。

2.6動(dòng)物模型的制備 將Ⅰ型細(xì)菌膠原酶溶解于生理鹽水中配制成15 g/L的溶液，大鼠使用麻醉機(jī)面罩給氧及2%異氟烷麻醉成功后，左下肢局部剃毛，于左后腿跟腱中心據(jù)跟骨上部10 mm處注射膠原蛋白酶溶液20 μL，構(gòu)建大鼠跟腱炎模型。模型建好3 d后，在相同注射部位按動(dòng)物分組分別注入PBS、hADSCs、hADSCs+NC、hADSCs+miR-34a和hADSCs+anti-miR-34a，各組注射細(xì)胞量約1×105個(gè)。術(shù)后4周頸椎脫臼法安樂(lè)死各組大鼠。切開(kāi)皮膚及皮下組織，將跟腱于小腿三頭肌起點(diǎn)切斷，跟腱遠(yuǎn)端包括跟骨在內(nèi)，在跟骨遠(yuǎn)端切斷。

2.7生物力學(xué)測(cè)定 將待測(cè)大鼠跟腱組織的兩端固定在材料試驗(yàn)機(jī)的夾具中，在恒溫恒濕的環(huán)境中進(jìn)行跟腱生物力學(xué)性能測(cè)定。測(cè)試期間不斷用生理鹽水滴浴潤(rùn)濕組織，預(yù)載荷為5 N，加載速率為10 mm/s，直至跟腱在中間處斷裂為止。記錄最大載荷拉力、最大拉伸長(zhǎng)度及壓力。跟腱硬度=最大負(fù)荷/最大拉伸長(zhǎng)度。

2.8RT-qPCR 取待測(cè)的各組大鼠跟腱組織，剪碎后研磨成漿，利用TRIzol試劑提取組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)miR-34a以及hADSCs成肌腱分化標(biāo)志物collagen I、Scx和TNC的mRNA表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。miR-34a的上游引物序列為5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3’，下游引物序列為5’-GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3’； collagen I的上游引物序列為5’-CCCTGGAAAGAATGGAGATG-3’，下游引物序列為5’-CCACTGAAACCTCTGTGTCC-3’； Scx的上游引物序列為5’-GCAAGCTCTCCAAGATTGTA-3’，下游引物序列為5’-CGTCTTTCTGTCACGGTCTT-3’； TNC的上游引物序列為5’-AAAGCAGCCACCCGCTATTA-3’，下游引物序列為5’-TCAGGTTCTTTGGCTGTGGAG-3’；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.9Western blot實(shí)驗(yàn) 利用RIPA裂解液，分別提取各組大鼠跟腱組織總蛋白，BCA法定量總蛋白后，取等量樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉 1 h。再用1%脫脂奶粉稀釋collagen I、Scx和TNC抗體以及內(nèi)參照β-actin抗體(1∶1 000)，孵育1 h，并于4 ℃過(guò)夜。最后在室溫下孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶3 000)，得到的蛋白條帶通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析；多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者行Dunnett’s檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-34a體外抑制hADSCs細(xì)胞的活力

體外分別轉(zhuǎn)染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后，hADSCs過(guò)表達(dá)或抑制miR-34a，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組相比，miR-34a過(guò)表達(dá)可顯著抑制hADSCs的活力(P<0.01)，而抑制miR-34a表達(dá)則明顯地促進(jìn)了hADSCs的活力(P<0.01)，轉(zhuǎn)染后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)上述作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。這表明miR-34a 在體外具有調(diào)控hADSCs活力的能力，且呈時(shí)間依賴性。

Figure 1.The viability of hADSCs was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.**P<0.01vspre-NC group.

圖1CCK-8法檢測(cè)hADSCs的活力

2 miR-34a影響hADSCs對(duì)跟腱炎模型大鼠的治療作用

5組大鼠跟腱組織的HE染色圖如圖2A所示。進(jìn)一步的跟腱組織生物力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與注射PBS組大鼠相比，單獨(dú)注射hADSCs可顯著提高大鼠跟腱組織硬度(P<0.01)、壓力(P<0.01)和最大負(fù)荷拉力(P<0.01)等生物力學(xué)指標(biāo)；而注射轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的hADSCs可減弱hADSCs的治療作用；反之，注射轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的hADSCs則增強(qiáng)hADSCs的治療作用，見(jiàn)圖2B～D。

Figure 2.The tendon tissues were detected by HE staining (A) and the changes of biomechanical indexes including tendon stiffness (B), stress (C) and maximum loading tension (D) were determined. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vshADSCs+NC group.

圖2大鼠肌腱組織HE染色結(jié)果及硬度、壓力和最大負(fù)荷拉力等生物力學(xué)指標(biāo)

3 miR-34a影響hADSCs對(duì)跟腱炎模型大鼠的促成肌腱分化能力

RT-qPCR檢測(cè)上述5組大鼠跟腱組織中miR-34a的表達(dá)水平，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，hADSCs+miR-34a組中miR-34a的表達(dá)水平顯著增加 (P<0.01)，而hADSCs+anti-miR-34a組中miR-34a的表達(dá)水平顯著降低 (P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The expression of miR-34a was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vshADSCs+NC group.

圖3RT-qPCR檢測(cè)miR-34a表達(dá)水平

與此同時(shí)，利用RT-q PCR和Western blot檢測(cè)大鼠跟腱組織中collagen I、Scx和TNC的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與PBS組相比，hADSCs組collagen I、Scx和TNC的表達(dá)水平增加；與hADSCs+NC組相比，hADSCs+miR-34a組collagen I、Scx和TNC的表達(dá)降低，而hADSCs+anti-miR-34a組collagen I、Scx和TNC的表達(dá)增加(P<0.01),見(jiàn)圖4。

討 論

目前，對(duì)于跟腱炎的治療主要集中在物理療法，手術(shù)介入以及藥物治療等方面，這些手段雖能在一定程度上緩解癥狀，但在恢復(fù)受損跟腱組織機(jī)能方面，仍無(wú)確切效果。近年來(lái)，有報(bào)道提出利用間充質(zhì)干細(xì)胞移植來(lái)取代受損及壞死組織，其在恢復(fù)肌腱功能方面有著較大優(yōu)勢(shì)[19]。但目前干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的增殖、分化情況大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。

MicroRNA是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示其具有維持細(xì)胞干性和促進(jìn)細(xì)胞自我更新等的生物學(xué)功能。miR-34a作為miR-34家族的一員，具有調(diào)控正常干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和凋亡等作用[20-22]。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)和抑制miRNA-34a表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)體外hADSCs細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制hADSCs細(xì)胞活力，反之，抑制miR-34a表達(dá)促進(jìn)hADSCs細(xì)胞活力。Park等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過(guò)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白抑制人脂肪干細(xì)胞增殖。同時(shí)還可抑制脂肪干細(xì)胞的成骨分化和成脂分化能力。與此研究結(jié)果類(lèi)似，Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-34a還可通過(guò)抑制cyclin D1和CDK6等蛋白表達(dá)抑制人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，并通過(guò)調(diào)控Jag1/Notch通路抑制人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。但也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過(guò)調(diào)節(jié)RBP2/Notch1/cyclin D1共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的成骨分化[14]。這些研究表明，在不同的細(xì)胞類(lèi)型或培養(yǎng)條件下，以及靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞分化中不同基因的轉(zhuǎn)錄水平，miR-34a可能發(fā)揮完全不同，甚至截然相反的作用。

Figure 4.The mRNA and protein levels of collagen I, Scx and TNC. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vshADSCs+NC group.

圖4CollagenI、Scx和TNC的mRNA及蛋白表達(dá)水平

過(guò)去，常采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療跟腱炎，但這樣不僅會(huì)給捐贈(zèng)者帶來(lái)生理上的疼痛，而且干細(xì)胞的獲得率也相對(duì)較低[24]。本研究采用脂肪來(lái)源的干細(xì)胞，不僅取材容易，分離率也能大大提高。為探究miR-34a對(duì)在體脂肪干細(xì)胞移植治療受損跟腱組織的影響，本研究將過(guò)表達(dá)和低表達(dá)miR-34a 的hADSCs移植入跟腱炎模型大鼠體內(nèi)，并檢測(cè)其生物力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果表明miR-34a過(guò)表達(dá)組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)(硬度、壓力和最大負(fù)荷拉力)均顯著降低，相反，miR-34抑制表達(dá)組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高，因此抑制miR-34a表達(dá)可以促進(jìn)跟腱炎大鼠的跟腱機(jī)能修復(fù)。

本文進(jìn)一步在分子水平上探討了miR-34a對(duì)脂肪干細(xì)胞的成肌腱分化能力的影響。在治療跟腱炎時(shí)，移植脂肪干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為成肌腱細(xì)胞，后者高表達(dá)成肌腱相關(guān)標(biāo)志物，主要包括collagen I、 Scx以及TNC等，其中，collagen I是成熟肌腱的主要成分[25]；Scx能特異性地標(biāo)記肌腱及原肌腱細(xì)胞，是肌腱細(xì)胞發(fā)育早期的特異標(biāo)志物[26]；TNC在體內(nèi)主要存在于肌腱組織中，使肌腱組織能夠承受一定的應(yīng)力，從而實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)功能[27]。我們的研究結(jié)果顯示，miR-34過(guò)表達(dá)可下調(diào)這些因子的表達(dá)；相反，抑制miR-34a表達(dá)則上調(diào)這些因子的表達(dá)。在脂肪干細(xì)胞移植治療跟腱炎時(shí)，抑制miR-34a表達(dá)可以促進(jìn)肌腱分化從而有助于修復(fù)受損肌腱組織。

綜上所述，抑制miR-34a表達(dá)在體外能促進(jìn)hADSCs的活力，在體內(nèi)移植抑制miR-34a表達(dá)的hADSCs可促進(jìn)成肌腱分化從而利于跟腱炎大鼠受損跟腱的修復(fù)。本研究為脂肪干細(xì)胞移植治療跟腱炎提供了新的研究靶點(diǎn)。