洪 雁， 趙 梅

(海南省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部， 海南 ?？?572000)

肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)過度增殖可導(dǎo)致肺血管狹窄或閉塞，是肺動脈高壓的最主要特征之一，在肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類非編碼小RNA，可通過靶向調(diào)控mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3],參與許多人類疾病的病理生理過程。已有研究表明miR-204、miR-130a、miR-124和miR-424等miRNAs在肺動脈高壓PASMCs增殖的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4-7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-339在肺動脈高壓大鼠中的表達(dá)下調(diào)[8]，然而miR-339 對 PASMCs的作用機(jī)制尚未有非常深入的研究。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究了miR-339對PASMCs增殖的影響并探討相關(guān)的分子機(jī)制，為臨床更好地治療肺動脈高壓提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞購于Sigma。DMEM-F12培養(yǎng)液及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于Thermo Fisher Scientific；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)購于 Sigma；CCK-8試劑盒購于北京碧云天公司；PCR引物、miR-339 模擬物(miR-339 mimic)、miR-339抑制物(miR-339 inhibitor)以及相應(yīng)的對照[模擬物陰性對照，mimic negative control(mimic NC); 抑制物對照，inhibitor NC]、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1，IGF2BP1)過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-IGF2BP1)以及相應(yīng)的對照(pcDNA3.1)購于廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑購于Invitrogen；PCR相關(guān)試劑購于TaKaRa；Western blot 相關(guān)抗體購于Abcam。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) PASMCs于含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第6代PASMCs用于實(shí)驗(yàn)。

2.2血管緊張素II處理以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用不同濃度的血管緊張素II (10、100和1 000 nmol/L)分別處理PASMCs 48 h后，使用Lipofectamine 2000試劑，根據(jù)說明書對PASMCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 后的PASMCs被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取 PASMCs中的mRNA和miRNA,使用PrimeScript RT試劑盒和One Step PrimeScript miRNA合成試劑盒分別將mRNA和miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照說明書，使用ABI7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和SYBR Green方法進(jìn)行qPCR，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，分別使用GAPDH和U6作為mRNA和miR-339的內(nèi)參照，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-339和相關(guān)mRNA的相對表達(dá)水平。miR-339的上游引物序列為5’-GGGTCCCTGTCCTCCA-3’，下游引物序列為5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’; PCNA的上游引物序列為5’- TCCTCCTTCCCGCCTGCCTGTAGC-3’,下游引物序列為5’- CGCGTTATCTTCGGCCCTTAGTGTA-3’; IGF2BP1的上游引物序列為5’-CAGGAGATGGTGCAGGTGTTTATCC-3’,下游引物序列為5’- GTTTGCCATAGATTCTTCCCTGAGC-3’; U6的上游引物序列為5’- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’, 下游引物序列為5’- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’,下游引物序列為5’- CACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。

2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞的增殖能力 取經(jīng)上述處理的PASMCs于96孔平板中培養(yǎng)48 h。棄上清液，每孔加入CCK-8溶液于37 ℃孵育2 h，然后通過酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值。將處理后的細(xì)胞利用胰酶消化后，利用0.04%臺盼藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色，TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),活細(xì)胞數(shù)=總細(xì)胞數(shù)-著色的死細(xì)胞數(shù)。

2.5螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 為了構(gòu)建螢光素酶報(bào)告基因載體，將含有miR-339結(jié)合位點(diǎn)的IGF2BP1 3’-UTR的野生型(WT)和突變的(MUT)片段克隆到pGL3報(bào)告螢火素酶載體中，分別命名為pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-WT和pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT。將PASMCs與pGL3構(gòu)建體，以及mimic NC、miR-339 mimic、inhibitor NC和miR-339 inhibitor共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙重螢光素酶測定法測定螢火蟲和海腎螢光素酶活性以確定螢光素酶的活性。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 通過使用裂解緩沖液從PASMCs 中提取蛋白，并且通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后，將PVDF膜用5%脫脂奶在室溫下封閉1 h，然后與抗IGF2BP1、p-p38、p38和β-actin抗體 4 ℃孵育過夜，再用PBST洗滌3次；將PVDF膜與HRP接合的 II 抗在室溫下孵育2 h。通過ECL試劑盒顯示蛋白條帶。使用β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。使用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)之間差異；使用單因素方差結(jié)合Bonferroni post hoc 檢驗(yàn)分析比較多組數(shù)據(jù)之間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血管緊張素II 對PASMCs的增殖以及miR-339表達(dá)的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，不同濃度的血管緊張素II處理PASMCs 48 h后，可顯著增加PASMCs的活力，且呈濃度依賴性(P<0.01),見圖1A。RT-qPCR結(jié)果顯示血管緊張素II可以濃度依賴性地增加PASMCs的PCNA mRNA表達(dá)水平，同時(shí)降低miR-339的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01),見圖1B、1C。

Figure 1.The effect of angiotensin II on cell viability and miR-339 of PCNA and in PASMCs. A:the cell viability was measured by CCK-8 assay; B and C: the mRNA expression of PCNA and miR-339 was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1血管緊張素II對PASMCs的增殖以及miR-339表達(dá)的影響

2 miR-339對PASMCs增殖的影響

轉(zhuǎn)染不同miRNA (mimic NC、miR-339 mimic、inhibitor NC和miR-339 inhibitor)48 h后，首先通過RT-qPCR檢測了PASMCs中的miR-339的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與mimic NC組相比，miR-339 mimic的轉(zhuǎn)染可以顯著增加PASMCs 中的miR-339的表達(dá)水平；與inhibitor NC組相比，miR-339 inhibitor的轉(zhuǎn)染可以顯著抑制PASMCs中miR-339的表達(dá)水平(P<0.01),見圖2A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與mimic NC組相比，miR-339 mimic的轉(zhuǎn)染顯著抑制PASMCs 的活力；與inhibitor NC組相比，miR-339 inhibitor的轉(zhuǎn)染可以顯著促進(jìn)PASMCs的活力(P<0.05,P<0.01),見圖2B。與mimic NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-339 mimic顯著抑制PCNA的mRNA表達(dá)水平；與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-339 inhibitor顯著促進(jìn)PCNA的mRNA表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01),見圖2C。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-339 mimic 轉(zhuǎn)染可以減少PASMCs的活細(xì)胞數(shù)量，而miR-339 inhibitor 轉(zhuǎn)染可以增加PASMCs的活細(xì)胞數(shù)量(P<0.05,P<0.01),見圖2D。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染mimic NC相比，miR-339 mimic 轉(zhuǎn)染可以抑制血管緊張素II處理后(1 μmol/L， 48 h)的PASMCs細(xì)胞增殖，見圖2E和2F。

3 IGF2BP1是miR-339的靶點(diǎn)

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，miR-339可以作用于IGF2BP1的3’-UTR區(qū)域,見圖3A；螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，miR-339過表達(dá)可以抑制pGL3-IGF2BP1 3’UTR-WT螢光素酶的活性，而miR-339表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)pGL3-IGF2BP1-3’-UTR-WT螢光素酶的活性(P<0.01)，見圖3B； miR-339的過表達(dá)或miR-339的表達(dá)下調(diào)對pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT螢光素酶活性都沒有顯著影響,見圖3C。RT-qPCR 以及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，與mimic NC組相比，miR-339 mimic的轉(zhuǎn)染顯著抑制PASMCs 中IGF2BP1 的mRNA和蛋白表達(dá)水平；與inhibitor NC組相比，miR-339 inhibitor的轉(zhuǎn)染可以顯著促進(jìn)IGF2BP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.01,P<0.05),見圖3D、3E。

4 IGF2BP1上調(diào)對PASMCs 增殖的影響

與pcDNA3.1組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IGF2BP1增加IGF2BP1的mRNA以及蛋白表達(dá)水平(P<0.01),見圖4A、4B。與pcDNA3.1+mimic NC 組對比，PASMCs 共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+miR-339 mimic 48 h后可以抑制細(xì)胞的活力，并降低PCNA的mRNA表達(dá)水平(P<0.01);而共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IGF2BP1+ miR-339 mimic 48 h可以增加細(xì)胞的增殖與PCNA的mRNA表達(dá)水平(P<0.01),見圖4C、4D。為了進(jìn)一步探討相關(guān)的信號通路，我們將轉(zhuǎn)染mimic NC和miR-339 mimic的PASMCs 利用Western blot 檢測了p-p38蛋白以及p38蛋白的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-339 mimic 轉(zhuǎn)染可以抑制p-p38蛋白的水平(P<0.01)，對p38蛋白的水平?jīng)]有影響,見圖4E。

Figure 2.The effect of miR-339 on cell proliferation in PASMCs. PASMCs were transfected with mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC and miR-339 inhibitor. At 48 h after transfection, the relative miR-339 expression (A) was determined by RT-qPCR, the cell viability was measured by CCK-8 assay (B), the mRNA expression of PCNA was detected by RT-qPCR (C), the viable cell numbers were determined by cell counting. Angiotensin II-treated PASMCs were transfected with mimic NC and miR-339 mimic, and at 48 h after transfection, the cell viability (E) and the viable cell numbers(F) were determined by CCK-8 assay, RT-qPCR and cell counting, respectively. NC: negative control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmimic NC group;△P<0.05vsAngII+mimicNC.#P<0.05,##P<0.01vsinhibitor NC group.

圖2miR-339對PASMCs增殖的影響

討 論

眾所周知，血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖在諸如動脈粥樣硬化、靜脈移植失敗、血管成形術(shù)后再狹窄以及肺動脈高壓等心血管疾病的發(fā)展中起著重要作用，抑制血管平滑肌的異常增殖可能讓我們有更好的途徑來預(yù)防和治療這些心血管疾病[9-10]。越來越多的證據(jù)表明miRNA在血管平滑肌的增殖中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道，miR-339在肺動脈高壓大鼠中的表達(dá)下調(diào)[8]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-339可以通過調(diào)控FGF信號通路從而抑制PASMCs的增殖。

血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖可以被各種細(xì)胞因子和生長因子如血管緊張素II、胰島素和血小板衍生生長因子誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素II可以促進(jìn)PASMCs細(xì)胞的增殖[11]，本研究 的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管緊張素II可以劑量依賴性地促進(jìn) PASMCs的活力。同時(shí)，血管緊張素II 促進(jìn)PCNA(細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)基因)的 mRNA 在PASMCs 中的表達(dá)水平。除此之外，血管緊張素II可以降低miR-339的表達(dá)水平，提示miR-339可能參與 PASMCs的增殖過程。在腫瘤的研究中, miR-339 可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移[12]。Jansson等[13]研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控MDM2的表達(dá)來促進(jìn)p53信號通路活性來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Wu等[14]發(fā)現(xiàn)miR-339可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)miR-339的過表達(dá)可以抑制 PASMCs的活力和活細(xì)胞數(shù)量，而miR-339的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)PASMCs的活力和活細(xì)胞數(shù)量，提示miR-339對PASMCs的增殖起到抑制作用。

Figure 3.IGF2BP1 was a direct target of miR-339. A: miR339 acts on the 3’-UTR of IGF2BP1; B and C: PASMCs were co-transfected with miRNAs (mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC and miR-339 inhibitor) and pGL3-IGF2BP1 3’UTR-WT/pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT, and at 48 h after transfection, luciferase activity was measured; D and E: PASMCs were transfected with mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC or miR-339 inhibitor, and at 48 h after transfection, the mRNA and protein expression of IGF2BP1 was determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmimic NC group;#P<0.05,##P<0.01vsinhibitor NC group.

圖3IGF2BP1是miR-339的靶點(diǎn)

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IGF2BP1是miR-339的一個(gè)下游靶點(diǎn)，通過螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-339可以作用于IGF2BP1的3’-UTR，RT-qPCR以及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-339可以負(fù)向調(diào)控IGF2BP1在PASMCs的表達(dá)。IGF2BP1作為一種RNA結(jié)合蛋白可以負(fù)調(diào)控IGF2的mRNA表達(dá)，很多研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP1在多種癌癥中起著癌基因的作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。此外，IGF2BP1被鑒定為包括miR-494、miR-150和 miR-625等幾種miRNA的靶點(diǎn)[16-18]。然而IGF2BP1對PASMCs的增殖作用尚未報(bào)道，本研究中我們發(fā)現(xiàn) IGF2BP1的過表達(dá)可以部分拮抗miR-339對PASMCs增殖的抑制作用，提示 miR-339對 PASMCs的增殖作用可能有部分是通過對 IGF2BP1的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素II可以激活p38 MAPK信號通路從而促進(jìn)PASMCs的增殖[19]，同時(shí)IGF2BP1是p38 MAPK的一個(gè)結(jié)合蛋白[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-339過表達(dá)可以抑制PASMCs中p-p38蛋白的表達(dá)，提示miR-339抑制PASMCs的增殖可能與調(diào)控p38 MAPK信號通路有關(guān)。

Figure 4.The effect of IGF2BP1 overexpression on cell proliferation in PASMCs. A and B: the mRNA and protein expression levels of IGF2BP1 were determined by RT-qPCR and Western blot, respectively; C: the cell viability was determined by CCK-8 assay; D: the mRNA expression of PCNA was determined by RT-qPCR; E: the protein expression levels of p-p38 and p38 were determined by Western blot. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.1 group;△△P<0.01vspcDNA3.1+mimic NC group;▲▲P<0.01vsmimic NC group;#P<0.05,##P<0.01vspcDNA3.1+miR-339 mimic group.

圖4IGF2BP1對PASMCs增殖的影響以及miR-339對p38MAPK信號通路的影響

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-339對PASMCs的增殖起到抑制作用，這種抑制作用可能部分通過調(diào)控IGF2BP1以及p38 MAKP信號通路來實(shí)現(xiàn)的，提示miR-339在肺動脈高血壓中起到一定的調(diào)控作用。將來有必要進(jìn)一步進(jìn)行動物體內(nèi)試驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)來確認(rèn)miR-339在肺動脈高血壓中的作用。