吳美華， 曾建斌， 熊向陽

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 3南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室, 江西 南昌 330006)

左心室射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)是指左室射血分?jǐn)?shù)正常，但由于心肌肥厚和間質(zhì)纖維化引起的室壁順應(yīng)性下降，使心室充盈受損，左心室舒張末壓增高、肺循環(huán)淤血、心搏量減少而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)的一組綜合征。HFpEF相關(guān)性肺動脈高壓(pulmonary hypertension due to HFpEF，PH-HFpEF)是指由HFpEF引起的肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，HFpEF患者出現(xiàn)PH與不良結(jié)局有關(guān)。微小RNA(microRNAs，miRNAs)為一種非編碼小分子RNA，通過調(diào)控基因表達，參與許多細胞的生理病理過程[1]。miRNAs穩(wěn)定存在于外周血[2-3]。在主動脈縮窄模型，心臟成纖維細胞高表達miR-21，升高的miR-21促進左室肥厚和纖維化，并抑制心臟成纖維細胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過上調(diào)抗凋亡的Bcl-2基因表達，抑制心肌成纖維細胞凋亡，促進HFpEF的形成[5]。但miR-21是否與PH-HFpEF有關(guān)還不清楚。我們設(shè)想，miR-21調(diào)節(jié)心臟肥厚、纖維化和心力衰竭的機制可能同時與PH-HFpEF有關(guān)。白細胞介素6 (interleukin-6,IL-6)是一種多功能的細胞因子，有學(xué)者報道IL-6水平升高與PH有關(guān)[6]。 內(nèi)皮素(endothelin，ET)是一種含21個氨基酸的多肽，具有強烈的血管收縮和促進平滑肌細胞增殖等作用。本研究主要檢測血漿miR-21、IL-6和ET-1水平，分析其與PH-HFpEF的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

選2014年1月～2017年2月，在江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的HFpEF患者，HFpEF的納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)有心力衰竭的癥狀和體征；(2)心臟(主要左心室)大小正常，且左室射血分?jǐn)?shù)>45%；(3)存在心臟結(jié)構(gòu)性改變(如左心房增大或左心室肥厚)和(或)心臟舒張功能障礙；(4)符合此類患者的人群流行病學(xué)特征，即大多為老年、女性、病因為高血壓或有長期高血壓病史，部分伴糖尿病或心房顫動等；(5)腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和(或)N 末端腦鈉尿肽原輕至中度升高，至少在灰色區(qū)域。對有三尖瓣反流的HFpEF患者，通過三尖瓣反流壓差法估測肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure，PASP)。在無肺動脈狹窄時，右心室收縮壓≈PASP=4v2+右心房壓，右心房壓根據(jù)下腔靜脈超聲特點確定，其中v是三尖瓣反流速度(m/s)。納入的HFpEF患者按PASP分為PH-HFpEF組(n=36，PASP≥50 mmHg)和HFpEF組(n=40，PASP<50 mmHg)，排除1、3、4、5類PH。另選年齡、性別相應(yīng)的同期健康體檢者作為對照(health control)組(n=36)。獲得知情同意書后，從肘靜脈取血以檢測miR-21等水平。

2 研究方法

2.1臨床檢測 采用Philips IE33型超聲診斷儀，探頭頻率1～5 MHz。取左側(cè)臥位，測量左心室舒張末內(nèi)徑、室間隔厚度和左心室后壁厚度、左房內(nèi)徑(left atrial diameter，LAD)，根據(jù)Devereux公式計算左心室重量(left ventricular mass，LVM)，左心室重量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)=LVM/體表面積。通過化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法測定血漿BNP水平；雙抗體夾心ELISA法測定 IL-6和ET-1水平。

2.2Real-time PCR檢測血漿miR-21水平 血漿miRNA的提取用miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，按照說明書提取總RNA。cDNA的合成用miScript II RT Kit (50) (Qiagen)。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物購自RiboBio。miR-21莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCGGATAC-GACTCAACA-3’；miR-21擴增上游引物為5’-GTTAGCTTATCAGACTGA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；內(nèi)參照cel-miR-39序列為5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’。miScript SYBR Green PCR Kit (200) (Qiagen)檢測miRNA的表達。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。 PCR擴增用Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀。每個樣本做3個復(fù)孔，獲得Ct值，并在同一板上做無模板對照。用 2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分率表示，組間比較應(yīng)用卡方檢驗或Fisher確切概率法。偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。miR-21與臨床資料(腦鈉尿肽和LAD等)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。血漿miR-21預(yù)測PH-HFpEF的準(zhǔn)確性用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析。多因素logistic回歸分析與PH-HFpEF獨立相關(guān)的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組患者的臨床特征

PH-HFpEF組患者年齡、血漿ET-1、血漿IL-6、腦鈉尿肽和LAD均高于HFpEF組(P<0.05或P<0.01); PH-HFpEF組的LVMI與HFpEF組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性; 性別、BMI、高血壓、糖尿病、冠心病和慢性腎病等的發(fā)生率各組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表1。

表1 PH-HFpEF組、HFpEF組及健康對照組臨床特征

PET-1: plasma endothelin-1; IL-6: interlukin-6; LVMI: left ventricular mass index; LAD: left atrial dimension; AF: atrial fibrilation; DM: diabetes mellitus; CNP: chronic nephrosis; COPD: chronic obstructive pulmonary disease; CHD: coronary heart disease; BMI: body mass index; BNP: brain natriuretic peptide; Q1: the first quartile; Q3: the third quartile.*P<0.05,**P<0.01vsHFpEF group.

2 各組患者血漿miR-21的相對表達水平

除健康對照組有2例未能檢出血漿miR-21外，其余各組均可檢測到miR-21。PH-HFpEF組的血漿miR-21水平明顯高于HFpEF組及健康對照組(分別P<0.05和P<0.01)，見圖1。

3 血漿miR-21預(yù)測PH-HFpEF的ROC曲線

以血漿miR-21水平為檢驗變量，以HFpEF是否出現(xiàn)PH為狀態(tài)變量作ROC曲線，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.80(P=0.000), 其95%可信區(qū)間為 0.703～0.897, 切點值為1.83，敏感性和特異性分別為77.8%和32.5%，見圖2。

4 血漿miR-21相對表達與血漿IL-6、ET-1、LAD、BNP、PH等的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，血漿miR-21與PASP (r=0.267，P=0.000)、血漿IL-6 (r=0.302，P=0.013)和 LVMI(r=0.515，P=0.036)相關(guān)，而與ET-1 (r=0.872，P=0.070)、BNP (r=0.607，P=0.52)和LAD (r=0.395，P=0.23)等無相關(guān)性。而血漿IL-6與ET-1正相關(guān) (r=0.622，P=0.002)。PASP與血漿IL-6 (r=0.36，P=0.023)、ET-1 (r=0.76，P=0.004)、BNP (r=0.43，P=0.031)及LAD (r=0.39,P=0.044)正相關(guān)。當(dāng)以HFpEF患者有或無PH為因變量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年齡、血漿miR-21相對表達、血漿IL-6、ET-1水平、LAD、BNP、BMI、LVMI等為自變量，進行多因素logistic回歸分析顯示，僅血漿miR-21相對表達水平、LAD和BNP與HFpEF患者出現(xiàn)PH正相關(guān)，是HFpEF患者肺高壓的獨立預(yù)測因素，見表2。

Figure 1.The relative expression of plasma miR-21. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vshealthy control group;#P<0.05vsHFpEF group.

圖1各組血漿miR-21相對表達比較

Figure 2.The area under the curve (AUC) analysis of receiver operating characteristic curve for diagnosis of PH in HFpEF patients.

圖2血漿miR-21水平與HFpEF患者出現(xiàn)PH的ROC曲線

討 論

PH是HFpEF的常見合并癥，由于采用標(biāo)準(zhǔn)不同，研究報道HFpEF患者PH的發(fā)生率為50%～80%[8-9]。與1類的動脈性肺動脈高壓不同，PH-HFpEF屬于2類PH。在PH的發(fā)生早期可能只與被動增加的左房壓(肺靜脈壓)有關(guān)。持續(xù)存在的肺靜脈壓升高導(dǎo)致肺靜脈和肺小動脈內(nèi)皮損害，功能紊亂，分泌血管活性介質(zhì)失衡(縮血管物質(zhì)分泌增加而舒血管的物質(zhì)分泌減少)和肺血管結(jié)構(gòu)改變，使肺動脈壓進一步升高。本研究的PH-HFpEF組血漿ET-1濃度明顯高于HFpEF組，也提示升高的ET-1可使肺血管收縮，導(dǎo)致肺動脈壓升高。

表2 多因素logistic回歸分析與HFpEF患者出現(xiàn)PH相關(guān)的因素

LAD: left atrial dimension; BNP: brain natriuretic peptide.

有研究表明，miR-21調(diào)節(jié)心肌成纖維細胞ERK-MAP激酶信號通路，對心臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。在衰竭心臟的心肌成纖維細胞，miR-21表達水平升高，miR-21通過增加分泌成纖維細胞生長因子2和抑制心肌成纖維細胞凋亡而促進心肌肥厚和纖維化，提示miR-21可能通過對心肌成纖維細胞的作用而成為HFpEF的重要調(diào)節(jié)器[4]。動物實驗顯示，拮抗miR-21表達可改善左室肥厚和纖維化[5]。本研究檢測了HFpEF患者外周血miR-21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與文獻報道的主動脈瓣狹窄所致的左室肥厚及肥厚型心肌病患者血漿可檢測到血miR-21升高相似[10]，HFpEF組血漿miR-21高于健康對照組，而且相關(guān)分析表明，血漿miR-21與LVMI相關(guān)。

miR-21是轉(zhuǎn)化生長因子β/骨形態(tài)蛋白信號通路的直接靶點。在人類血管平滑肌細胞，轉(zhuǎn)化生長因子β和骨形態(tài)蛋白都可通過增加細胞miR-21的水平來抑制程序性細胞死亡蛋白4，從而增加收縮性基因的表達[11]。來自計算機預(yù)測、細胞培養(yǎng)及動物模型的證據(jù)都表明，miR-21結(jié)合多種信號通路調(diào)控PH[12]。還有研究表明，miR-21 參與慢性缺氧引起的肺血管重構(gòu)[13]。本研究顯示，PH-HFpEF組血漿miR-21高于HFpEF組。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血漿miR-21與PASP正相關(guān)，也提示血漿miR-21升高與HFpEF患者肺高壓有關(guān)。另外，血漿ET-1、IL-6、BNP、LAD等都分別與PASP相關(guān)。為排除混雜因素的干擾，當(dāng)以HFpEF患者有或無PH為因變量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年齡、miR-21相對表達、血漿IL-6、ET-1、LAD、BNP、BMI、LVMI等為自變量，進行多因素logistic回歸分析顯示，血漿miR-21相對表達水平仍與HFpEF患者出現(xiàn)PH獨立相關(guān)。Wei等[14]研究也表明，與對照組比，經(jīng)右心導(dǎo)管確診的PH患者,循環(huán)miR-204、miR-21升高，并推測可能從受損的血管釋放到循環(huán)，支持本研究結(jié)果。

一些研究證實，血管平滑肌、內(nèi)皮和心臟成纖維細胞高表達miR-21，而心肌細胞是否表達miR-21，結(jié)果不一致[15-18]。Xu等[19]研究表明，心力衰竭患者竭力運動時，血漿miR-21表達增加。鑒于循環(huán)miRNA 表達的改變可能涉及不同機制，包括細胞釋放或轉(zhuǎn)錄的變化。 推測當(dāng)HFpEF患者病情加重，出現(xiàn)PH時，承受壓力的肺血管可能釋放更多miR-21入血，使PH-HFpEF組血漿miR-21表達增加。

IL-6 是一種多功能循環(huán)細胞因子，與機體炎癥、宿主抵抗、組織損傷的免疫作用相關(guān)，由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞產(chǎn)生和分泌。 Wang等[20]報道ET-l促使大鼠血管平滑肌細胞分泌 IL-6。有研究顯示，在重度肺高壓炎癥模型，過表達人IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠肺織 miR-21上調(diào)6倍[21]。而L｀ffler 等[22]研究表明，IL-6可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄miR-21。本研究發(fā)現(xiàn)，PH-HFpEF組血漿IL-6水平明顯升高，而且血漿miR-21與 IL-6相關(guān),提示PH-HFpEF時升高的IL-6可能誘導(dǎo)肺組織miR-21轉(zhuǎn)錄增加，并釋放到血液中導(dǎo)致血循環(huán)miR-21升高。

最近有研究提示，miRNA 可由不同器官的某種細胞類型產(chǎn)生，可像激素樣被運輸?shù)叫?yīng)器起作用[23]。因此推測PH-HFpEF時升高的IL-6也可能誘導(dǎo)心肌成纖維細胞釋放miR-21增加，并被運送到肺血管在PH-HFpEF中起調(diào)節(jié)作用。

本研究進一步ROC曲線分析還發(fā)現(xiàn)，血漿miR-21診斷PH-HFpEF的ROC曲線下面積為0.80(0.703～0.897),提示血漿miR-21或可作為PH-HFpEF的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測PH-HFpEF。

本研究的缺陷是PH-HFpEF未經(jīng)右心導(dǎo)管檢查核實，而是通過超聲估測。不過根據(jù)歐洲PH診斷指南，當(dāng)超聲估測的PASP>50 mmHg時，其準(zhǔn)確度接近右心導(dǎo)管[24]。其次，血漿miR-21與遠隔臟器表達的生物學(xué)關(guān)聯(lián)還不明確，有待進一步研究。

總之，本研究表明，血漿miR-21與PH-HFpEF正相關(guān)，是PH-HFpEF的獨立預(yù)測因素，可能是PH-HFpEF的生物標(biāo)志物。但由于本研究是單中心、小樣本的研究，結(jié)果應(yīng)在多中心、大樣本的研究中進一步驗證。

致謝：本研究實施過程中得到醫(yī)院信息科和病案室在資料收集方面的熱心幫助，在此一并感謝。